Metodi di trasfezione genetica nella terapia genica. Terapia genetica

Oggi la terapia genica sta finalmente cominciando a giustificare le speranze che un tempo vi si riponevano. Negli ultimi sei anni, a seguito dell'introduzione di specifici geni funzionali in parti del corpo del paziente, è stato possibile ripristinare la vista in 40 pazienti affetti da cecità ereditaria. Brillanti risultati sono stati raggiunti nella lotta contro varie forme di leucemia: su 120 soggetti, diversi pazienti hanno ottenuto la remissione, che dura da tre anni. La terapia genica ha dimostrato la sua efficacia nella lotta contro l'emofilia, una malattia ereditaria, che a volte porta alla morte del paziente. Ora il paziente non ha bisogno di assumere farmaci ad alte dosi che aumentano la coagulazione del sangue e hanno pericolosi effetti collaterali.

I risultati positivi sono stati accolti con grande entusiasmo anche perché la terapia genica è stata sospesa 15 anni fa dopo la prematura scomparsa di Jesse Gelsinger, un adolescente con un raro disturbo digestivo. Il sistema immunitario di un giovane ha reagito all'introduzione di un gene estraneo in modo così violento che il corpo non poteva sopportarlo. Il successo della terapia genica negli anni '90 non è stato così impressionante come previsto.

Tutto ciò ci ha fatto riconsiderare alcuni dei metodi utilizzati e valutare più sobriamente le possibilità di utilizzare la terapia genica per eliminare varie patologie. Ho dovuto separarmi dalle illusioni e tornare alla ricerca fondamentale. Innanzitutto era necessario stabilire la causa dei possibili effetti collaterali (come quelli che hanno portato alla morte di Gelsinger) e imparare a evitarli. Si sarebbe dovuta prestare maggiore attenzione alla comunicazione con i pazienti e i loro parenti, in modo che la decisione presa fosse consapevole.

La svolta è arrivata sei anni fa, dopo che la terapia genica ha curato un bambino di otto anni di nome Corey Haas che soffriva di una malattia degenerativa dell'occhio. Inizialmente, a seguito di manipolazioni genetiche, la proteina mancante iniziò a essere prodotta nella retina colpita dell'occhio sinistro e, quattro giorni dopo l'operazione, il ragazzo visitò lo zoo e, con sua indescrivibile gioia, si rese conto che stava vedendo un cielo azzurro e palloncini colorati. Tre anni dopo, manipolazioni simili furono eseguite con l'occhio destro. Ora Corey può vedere così bene che può andare a caccia con suo nonno.

Finora, la terapia genica non è entrata nell'arsenale dei praticanti, ma c'è la speranza che ciò avvenga nei prossimi dieci anni. Nel 2012 si è tentato in Europa di utilizzarlo per eliminare una patologia rara ma estremamente dolorosa, il cosiddetto deficit familiare di lipoproteina lipasi. Gli Stati Uniti dovrebbero ottenere l'approvazione per l'uso della terapia genica in medicina nel 2016, e poi dovranno recuperare quanto perso in dieci anni di inattività.

Crudele delusione

I fallimenti che hanno colpito i ricercatori nelle prime fasi dell'applicazione pratica della terapia genica hanno mostrato chiaramente quanto sia difficile prevedere tutte le conseguenze dell'introduzione di geni estranei nell'organismo. Troppo spesso, i sistemi di consegna più sicuri non sono abbastanza efficaci e alcuni dei sistemi di consegna più efficaci non sono sicuri: si verifica una risposta immunitaria iperattiva, come nel caso di Gelsinger, o si sviluppa la leucemia.

Per capire cosa provoca gli effetti collaterali e come ridurne il rischio, i genetisti si sono concentrati sullo studio attento del sistema di rilascio genico più comune: l'ingegneria dei virus che agiscono come una microscopica siringa per iniezione.

In primo luogo, una parte significativa del DNA virale è stata rimossa per fare spazio ai geni destinati ad essere introdotti nel corpo del paziente. (Questa procedura rendeva simultaneamente il virus incapace di replicarsi.) Il virus trasformato che trasportava i geni bersaglio è stato iniettato nella parte corretta del corpo, dove li ha inseriti nelle regioni appropriate del DNA cellulare, a seconda del tipo di virus.

Durante il periodo in cui Gelsinger si è offerto volontario negli studi clinici sulla terapia genica, il sistema più comune di rilascio di geni estranei nell'uomo erano gli adenovirus, che di solito causano lievi infezioni delle vie respiratorie superiori. Secondo i ricercatori dell'Università della Pennsylvania, il miglior risultato è un'iniezione del virus nel fegato; è qui che si trovano le cellule che producono l'enzima digestivo che mancava a Gelsinger. Una copia funzionale del gene per questo enzima è stata inserita in una particella virale inattivata e un trilione di tali particelle è stato iniettato nel fegato del paziente.

Sfortunatamente, alcune delle particelle sono entrate non solo nelle cellule del fegato, come avrebbero dovuto, ma anche in un numero enorme di macrofagi: grandi cellule, "sentinella" del sistema immunitario e cellule dendritiche, notificando quest'ultime dell'invasione di agenti stranieri. Il sistema immunitario iniziò immediatamente a distruggere tutte le cellule infette e questo processo violento alla fine uccise il paziente.

La gravità della risposta immunitaria ha stupito i ricercatori. Nessuno degli altri 17 volontari aveva niente di simile. Era noto che l'adenovirus poteva innescare una risposta immunitaria, ma a parte l'incidente con una scimmia a cui è stato iniettato un adenovirus leggermente diverso da quello descritto sopra, il caso di Gelsinger era unico. "La popolazione umana è molto più eterogenea di quella animale", afferma James Wilson dell'Università della Pennsylvania, che ha sviluppato il sistema di rilascio genico mirato utilizzato negli studi clinici che coinvolgono Gelsinger. "E nel nostro caso, un paziente in qualcosa di significativo diverso dagli altri». Forse la tragedia non si sarebbe verificata se la dose del virus fosse stata inferiore: non un trilione di particelle, ma diversi miliardi. Un altro inconveniente era che né il paziente stesso né i suoi parenti erano stati informati della morte della scimmia in test simili e nessuno sapeva quale decisione avrebbero preso se avessero saputo dell'incidente.

La tragedia successa a Gelsinger non fu l'ultima. Ben presto si tentò di eliminare un'altra patologia con l'aiuto della terapia genica: grave immunodeficienza combinata XI (SCID-X1). I test hanno coinvolto 20 bambini; cinque di loro hanno sviluppato la leucemia e un bambino è morto. E ancora, la colpa era del sistema di consegna, anche se in questo caso è stato utilizzato un altro vettore: un retrovirus che inserisce i geni bersaglio direttamente nel DNA cellulare. La loro posizione esatta nel genoma varia leggermente e talvolta si accendono vicino all'oncogene, che, in determinate condizioni, porta alla comparsa del cancro.

Revisione tecnologica

Le tragiche conseguenze dell'uso di retro e adenovirus come vettori ci hanno costretto a rivolgerci ad altri vettori. Di conseguenza, sono stati selezionati due virus.

Il primo di questi, il virus adeno-associato (AAV), non causa alcuna infezione nell'uomo. La maggior parte di noi prima o poi nella nostra vita ne diventa portatrice, ed è proprio per questo che è improbabile che il sistema immunitario vi risponda quando agisce da vettore. L'AAV ha un'altra caratteristica che aiuta a ridurre al minimo il rischio di effetti collaterali: è rappresentato da molte varietà (sierotipi), ognuna delle quali preferisce infettare le cellule del proprio organo o tessuto. Quindi, per AAV2, questi sono gli occhi, per AAV8, il fegato, per AAV9, il muscolo cardiaco e il cervello. È possibile selezionare il ceppo virale ottimale per la parte del corpo bersaglio e ridurre al minimo la risposta immunitaria e altri effetti indesiderati. Inoltre, AAVue incorpora il suo materiale genetico nel genoma della cellula ospite e quindi non può causare il cancro attivando casualmente gli oncogeni.

Il virus adeno-associato è stato testato per la prima volta per la sua capacità di fornire materiale genetico ai tessuti bersaglio nel 1996. I test sono stati condotti su volontari affetti da fibrosi cistica. Da allora sono stati identificati 11 sierotipi del virus e dai loro componenti sono stati costruiti centinaia di vettori sicuri e selettivi. I vettori basati su AAV sono attualmente in fase di test per la terapia genica in patologie come il morbo di Parkinson e l'Alzheimer, nonché emofilia, distrofia muscolare, insufficienza cardiaca e cecità.

Il secondo virus, sorprendentemente, è una versione indebolita del virus dell'immunodeficienza umana, l'agente eziologico dell'AIDS. Dimentichiamoci per un momento della sua cattiva reputazione e soffermiamoci sui suoi vantaggi come vettore. L'HIV è un membro del genere Lentivirus della famiglia rstrovirus. Colpisce le cellule del sistema immunitario e, cosa molto importante, non attiva gli oncogeni.

Se rimuoviamo i geni responsabili dell'effetto letale dell'HIV, otteniamo un vettore eccellente con un'ampia gamma di possibilità. Così afferma Stuart Naylor, ex direttore scientifico dell'azienda inglese Oxford Biomedica. Contrariamente al più piccolo AAV, l'HIV "neutralizzato" è adatto per il trasferimento di più geni contemporaneamente. Non è tossico e non provoca una risposta immunitaria. Privati ​​della capacità di provocare infezioni, i lentivirus sono in fase di test per la possibilità di utilizzarli per eliminare varie patologie, in particolare l'adenoleucodistrofia. Ad oggi diversi ragazzi con questa diagnosi hanno potuto tornare a scuola grazie alla terapia genica.

Parallelamente alle sperimentazioni cliniche che utilizzano HIV AAVn, sono in corso lavori per modificare i vecchi vettori virali in modo che possano essere utilizzati in determinate circostanze. Quindi, i retrovirus (ad eccezione dell'HIV) sono geneticamente modificati in modo da non causare la leucemia.

Anche l'adenovirus, il cui uso ha portato alla morte di Gelsinger, non sarà del tutto respinto. Ora viene iniettato solo in parti del corpo dove è improbabile che susciti una risposta immunitaria. Una potenziale applicazione è la terapia genica per la xerotomia (secchezza delle fauci) in pazienti che sono stati esposti a radiazioni per tumori della testa e del collo. in cui le ghiandole salivari sono danneggiate.

Il National Institutes of Health sta conducendo una sperimentazione clinica (che coinvolge un piccolo numero di volontari) di un approccio basato sull'introduzione in cellule appropriate di geni che mediano la formazione di canali per il passaggio dell'acqua alle ghiandole salivari. Poiché questi ultimi sono piccoli e più o meno isolati e la dose del virus è 1.000 volte inferiore a quella che Gelsinger ha ricevuto una volta, la probabilità di una reazione immunitaria eccessivamente forte è ridotta al minimo. Le particelle di virus che non hanno raggiunto le cellule bersaglio, secondo gli sviluppatori, dovrebbero essere distrutte nella saliva, sputate con essa o ingerite, il che riduce ancora una volta il rischio di sviluppare una risposta immunitaria. Dal 2006, questo metodo ha migliorato significativamente le condizioni di 11 pazienti.

Nuovi obiettivi

Incoraggiati dal successo, i genetisti medici hanno ampliato la portata della terapia genica e hanno cercato di eliminare i difetti genetici non ereditari con il suo aiuto.

Ad esempio, l'Università della Pennsylvania sta già utilizzando questo approccio nella lotta contro uno dei tumori infantili più comuni: la leucemia linfoblastica acuta (ALL). Circa il 20% dei bambini con questa diagnosi non è aiutato dalla chemioterapia convenzionale.

La terapia genica in questi casi è particolarmente complessa e si basa sull'uso di recettori chimerici dell'antigene (CAR). Come le chimere dell'antica mitologia greca, costituite da parti del corpo di diversi animali, questi recettori sono un complesso di due componenti del sistema immunitario che normalmente non si trovano nel corpo. Le cellule T a cui è attaccato acquisiscono la capacità di ricercare proteine ​​specifiche presenti nelle cellule leucemiche in quantità maggiori rispetto alle cellule normali e di distruggere le cellule anormali. I primi soggetti sono stati pazienti adulti affetti da leucemia cronica: i risultati sono stati incoraggianti. L'esito delle sperimentazioni sui bambini malati ha superato ogni aspettativa.

Quando a Emily Whitehead è stata diagnosticata la leucemia nel maggio 2010, aveva nove anni. Due cicli di chemioterapia sono falliti. Nella primavera del 2012 è stato dato un terzo corso che avrebbe potuto uccidere un adulto, ma la ragazza è sopravvissuta, sebbene abbia sviluppato problemi ai reni, al fegato e alla milza. Secondo il medico curante Bruce Levine. "Emily era sull'orlo della morte."

Poi le hanno prelevato il sangue, hanno isolato i linfociti T e gli hanno iniettato il lentivirus. nel genoma di cui erano precedentemente inclusi i geni bersaglio. Dopo l'iniezione di cellule T chimeriche nel corpo della paziente, le sue condizioni hanno iniziato a migliorare rapidamente. Tre settimane dopo, il 25% delle cellule T nel suo midollo osseo sono state geneticamente modificate e hanno iniziato a "cacciare" le cellule tumorali. “Ad aprile, la ragazza è diventata completamente calva. - ricorda Levin, - e ad agosto aveva acquisito il suo aspetto precedente ed era pronto per la scuola.

È improbabile che le cellule T modificate funzionino per il resto della sua vita, ma la procedura può sempre essere ripetuta. Nel frattempo, questa bella ragazza con folti capelli castani è priva di cellule tumorali. Nell'autunno del 2013, diversi gruppi di genetisti medici hanno segnalato contemporaneamente l'uso della tecnica CAR per il trattamento di 120 pazienti con la stessa forma di leucemia di Emily Whitehead, nonché con altre forme. Cinque adulti e 19 dei 22 bambini sono andati in remissione.

prospettive

Ora, la prossima sfida per gli specialisti di terapia genica è ottenere l'approvazione dalla Food and Drug Administration (FDA) per utilizzare il loro sistema di vettori più sicuro di tutto nella clinica. È necessario organizzare una sperimentazione clinica di fase III che coinvolga un folto gruppo di volontari. Questo di solito richiede da uno a cinque anni. Alla fine del 2013, circa il 5% delle 2.000 prove ha raggiunto questa fase. I creatori del metodo di trattamento dei pazienti affetti dalla malattia di Leber (perdita bilaterale della vista a causa di una mutazione nel DNA mitocondriale: Haas di otto anni aveva questa patologia) sono avanzati più di altri. Diverse dozzine di pazienti sono già riuscite a ripristinare la vista con l'aiuto della terapia genica.

La distrofia muscolare di Duchenne è una delle malattie genetiche rare, ma ancora relativamente comuni. La malattia viene diagnosticata all'età di tre-cinque anni, di solito nei ragazzi, manifestandosi inizialmente solo con movimenti difficili, all'età di dieci anni, una persona che soffre di tale miodistrofia non può più camminare, all'età di 20-22 anni la sua la vita finisce. È causato da una mutazione nel gene della distrofina, che si trova sul cromosoma X. Codifica una proteina che collega la membrana cellulare muscolare alle fibre contrattili. Funzionalmente, questa è una specie di molla che assicura una contrazione regolare e l'integrità della membrana cellulare. Le mutazioni nel gene portano alla distrofia del tessuto muscolare scheletrico, del diaframma e del cuore. Il trattamento della malattia è di natura palliativa e può alleviare solo leggermente la sofferenza. Tuttavia, con lo sviluppo dell'ingegneria genetica, c'è luce alla fine del tunnel.

A proposito di guerra e pace

La terapia genica è la consegna di costrutti a base di acidi nucleici nelle cellule per il trattamento di malattie genetiche. Con l'aiuto di tale terapia, è possibile correggere un problema genetico a livello di DNA e RNA modificando il processo di espressione della proteina desiderata. Ad esempio, il DNA con una sequenza corretta può essere consegnato a una cellula, da cui viene sintetizzata una proteina funzionale. Oppure, al contrario, sono possibili eliminazioni di alcune sequenze genetiche, che aiuteranno anche a ridurre gli effetti dannosi della mutazione. In teoria questo è semplice, ma in pratica la terapia genica si basa sulle più complesse tecnologie per lavorare con oggetti microscopici e rappresenta un insieme di conoscenze avanzate nel campo della biologia molecolare.

L'iniezione di DNA nel pronucleo dello zigote è una delle prime e più tradizionali tecnologie per la creazione di transgeni. L'iniezione viene eseguita manualmente utilizzando aghi ultrasottili al microscopio con ingrandimento 400x.

"Il gene della distrofina, le cui mutazioni danno origine alla distrofia muscolare di Duchenne, è enorme", afferma Vadim Zhernovkov, direttore dello sviluppo presso la società di biotecnologie Marlin Biotech, candidato alle scienze biologiche. - Comprende 2,5 milioni di coppie di basi, che potrebbero essere paragonate al numero di lettere del romanzo Guerra e Pace. E ora immagina di aver strappato alcune pagine importanti dall'epopea. Se in queste pagine vengono descritti eventi significativi, la comprensione del libro sarebbe già difficile. Ma con il gene, tutto è più complicato. Non è difficile trovare un'altra copia di Guerra e Pace, e quindi si potrebbero leggere le pagine mancanti. Ma il gene della distrofina si trova sul cromosoma X e gli uomini ne hanno solo uno. Pertanto, solo una copia del gene è immagazzinata nei cromosomi sessuali dei ragazzi alla nascita. Non c'è altro posto dove prenderlo.

Infine, nella sintesi proteica dall'RNA, è importante preservare il frame di lettura. Il frame di lettura determina quale gruppo di tre nucleotidi viene letto come un codone, che corrisponde a un amminoacido in una proteina. Se c'è una cancellazione nel gene di un frammento di DNA che non è un multiplo di tre nucleotidi, si verifica uno spostamento nel frame di lettura: la codifica cambia. Questo potrebbe essere paragonato alla situazione in cui, dopo aver strappato le pagine dell'intero libro rimanente, tutte le lettere verranno sostituite dalle successive in ordine alfabetico. Prendi abracadabra. Questa è la stessa cosa che accade a una proteina che non è sintetizzata correttamente”.

Cerotto biomolecolare

Uno dei metodi efficaci di terapia genica per ripristinare la normale sintesi proteica è il salto dell'esone utilizzando brevi sequenze nucleotidiche. Marlin Biotech ha già sviluppato una tecnologia per lavorare con il gene della distrofina utilizzando questo metodo. Come è noto, nel processo di trascrizione (sintesi di RNA) si forma dapprima il cosiddetto RNA pretemplate, che comprende sia regioni codificanti proteine ​​(esoni) sia regioni non codificanti (introni). Successivamente, inizia il processo di splicing, durante il quale introni ed esoni vengono separati e si forma un RNA "maturo", costituito solo da esoni. In questo momento, alcuni esoni possono essere bloccati, "incollati" con l'aiuto di molecole speciali. Di conseguenza, l'RNA maturo non avrà quelle regioni codificanti di cui preferiremmo sbarazzarci, e quindi il frame di lettura verrà ripristinato, la proteina verrà sintetizzata.

"Abbiamo eseguito il debug di questa tecnologia in vitro", afferma Vadim Zhernovkov, ovvero su colture cellulari cresciute da cellule di pazienti con miodistrofia di Duchenne. Ma le singole cellule non sono un organismo. Invadendo i processi della cellula, bisogna osservarne le conseguenze dal vivo, ma non è possibile coinvolgere le persone nelle prove per vari motivi, da quelli etici a quelli organizzativi. Pertanto, è diventato necessario ottenere un modello di distrofia muscolare di Duchenne con alcune mutazioni basato su un animale da laboratorio".

Come pungere il micromondo

Gli animali transgenici sono animali ottenuti in laboratorio, nel cui genoma vengono apportati cambiamenti intenzionalmente e consapevolmente. Già negli anni '70 è diventato chiaro che la creazione di transgeni è il metodo più importante per studiare le funzioni di geni e proteine. Uno dei primi metodi per ottenere un organismo completamente geneticamente modificato è stata l'iniezione di DNA nel pronucleo ("precursore del nucleo") degli zigoti delle uova fecondate. Questo è logico, poiché è più facile modificare il genoma di un animale proprio all'inizio del suo sviluppo.

Il diagramma mostra il processo CRISPR/Cas9, che coinvolge l'RNA subgenomico (sgRNA), la sua regione che funge da RNA guida e la proteina nucleasi Cas9, che taglia entrambi i filamenti di DNA genomico nel sito indicato dall'RNA guida.

L'iniezione nel nucleo dello zigote è una procedura molto non banale, perché stiamo parlando di microscale. L'uovo di topo ha un diametro di 100 µm e il pronucleo è di 20 µm. L'operazione avviene al microscopio con ingrandimento 400x, ma l'iniezione è il lavoro più manuale. Ovviamente per l'“iniezione” non viene utilizzata una siringa tradizionale, ma uno speciale ago di vetro con all'interno un canale cavo, dove viene raccolto il materiale genetico. Un'estremità può essere tenuta in mano, mentre l'altra è ultrasottile e affilata, praticamente invisibile ad occhio nudo. Naturalmente, una struttura così fragile in vetro borosilicato non può essere conservata a lungo, quindi il laboratorio ha a disposizione una serie di grezzi, che vengono disegnati su una macchina speciale immediatamente prima del lavoro. Viene utilizzato uno speciale sistema di imaging a contrasto cellulare senza colorazione: l'intervento nel pronucleo è di per sé traumatico ed è un fattore di rischio per la sopravvivenza cellulare. La vernice sarebbe un altro fattore del genere. Fortunatamente, le uova sono abbastanza resistenti, ma il numero di zigoti che danno origine ad animali transgenici è solo una piccola percentuale del numero totale di uova a cui è stato iniettato il DNA.

Il prossimo passo è chirurgico. È in corso un'operazione per trapiantare zigoti microiniettati nell'imbuto dell'ovidotto del topo ricevente, che diventerà una madre surrogata per futuri transgeni. Successivamente, l'animale da laboratorio attraversa naturalmente un ciclo di gravidanza e nasce la prole. Di solito nella cucciolata ci sono circa il 20% di topi transgenici, il che indica anche l'imperfezione del metodo, perché contiene un grande elemento di casualità. Quando viene iniettato, il ricercatore non può controllare esattamente come i frammenti di DNA inseriti verranno integrati nel genoma del futuro organismo. Esiste un'alta probabilità di tali combinazioni che porteranno alla morte dell'animale nella fase embrionale. Tuttavia, il metodo funziona ed è abbastanza adatto per una serie di scopi scientifici.

Lo sviluppo di tecnologie transgeniche consente di produrre proteine ​​animali richieste dall'industria farmaceutica. Queste proteine ​​sono estratte dal latte di capre e mucche transgeniche. Esistono anche tecnologie per ottenere proteine ​​specifiche dalle uova di gallina.

Forbici del DNA

Ma esiste un modo più efficiente basato sull'editing mirato del genoma utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9. "Oggi, la biologia molecolare è in qualche modo simile all'era delle spedizioni marittime a vela a lunga distanza", afferma Vadim Zhernovkov. — Quasi ogni anno in questa scienza ci sono scoperte significative che possono cambiare le nostre vite. Ad esempio, diversi anni fa, i microbiologi hanno scoperto l'immunità alle infezioni virali in una specie di batteri apparentemente studiata a lungo. Come risultato di ulteriori studi, si è scoperto che il DNA batterico contiene loci speciali (CRISPR), da cui vengono sintetizzati frammenti di RNA che possono legarsi in modo complementare agli acidi nucleici di elementi estranei, ad esempio DNA o RNA di virus. La proteina Cas9, che è un enzima nucleasi, si lega a tale RNA. L'RNA funge da guida per Cas9, contrassegnando una sezione specifica del DNA in cui la nucleasi effettua un taglio. Circa tre o cinque anni fa, sono apparsi i primi articoli scientifici che hanno sviluppato la tecnologia CRISPR/Cas9 per l'editing del genoma".

I topi transgenici consentono di creare modelli viventi di gravi malattie genetiche umane. Le persone dovrebbero essere grate a queste minuscole creature.

Rispetto al metodo del costrutto di inserimento casuale, il nuovo metodo consente di selezionare elementi del sistema CRISPR/Cas9 in modo tale da indirizzare accuratamente le guide RNA alle regioni desiderate del genoma e ottenere la cancellazione o l'inserimento mirati del DNA desiderato sequenza. Sono possibili errori anche in questo metodo (l'RNA guida a volte si collega al sito sbagliato a cui è mirato), ma quando si utilizza CRISPR/Cas9, l'efficienza della creazione di transgeni è già di circa l'80%. "Questo metodo ha ampie prospettive, non solo per la creazione di transgeni, ma anche in altri settori, in particolare nella terapia genica", afferma Vadim Zhernovkov. “Tuttavia, la tecnologia è solo all'inizio del suo viaggio ed è piuttosto difficile immaginare che nel prossimo futuro le persone saranno in grado di correggere il codice genetico delle persone che utilizzano CRISPR/Cas9. Finché c'è la possibilità di errore, c'è anche il pericolo che una persona perda alcune importanti parti codificanti del genoma".

Medicina del latte

L'azienda russa Marlin Biotech è riuscita a creare un topo transgenico in cui è completamente riprodotta la mutazione che porta alla distrofia muscolare di Duchenne e la fase successiva sarà la sperimentazione delle tecnologie di terapia genica. Tuttavia, la creazione di modelli di malattie genetiche umane basati su animali da laboratorio non è l'unica possibile applicazione dei transgeni. Pertanto, in Russia e nei laboratori occidentali, sono in corso lavori nel campo della biotecnologia, che consente di ottenere proteine ​​medicinali di origine animale importanti per l'industria farmaceutica. Mucche o capre possono fungere da produttori, in cui è possibile modificare l'apparato cellulare per la produzione delle proteine ​​contenute nel latte. È possibile estrarre una proteina medicinale dal latte, che si ottiene non con un metodo chimico, ma con un meccanismo naturale, che aumenterà l'efficacia del farmaco. Attualmente, sono state sviluppate tecnologie per ottenere proteine ​​medicinali come lattoferrina umana, prourochinasi, lisozima, atrin, antitrombina e altre.

La terapia genica è il trattamento ereditario, non ereditario, che viene effettuato introducendo altri geni nelle cellule del paziente. L'obiettivo della terapia è eliminare i difetti genetici o dare alle cellule nuove funzioni. È molto più facile introdurre in una cellula un gene sano e perfettamente funzionante che correggere i difetti in uno esistente.

La terapia genica è limitata agli studi sui tessuti somatici. Ciò è dovuto al fatto che qualsiasi intervento sul sesso e sulle cellule germinali può dare un risultato del tutto imprevedibile.

La tecnica attualmente utilizzata è efficace nel trattamento di malattie sia monogeniche che multifattoriali (tumori maligni, alcuni tipi di gravi malattie cardiovascolari, virali).

Circa l'80% di tutti i progetti di terapia genica riguardano l'infezione da HIV e sono attualmente oggetto di ricerca come emofilia B, fibrosi cistica, ipercolesterolemia.

Il trattamento include:

isolamento e propagazione di singoli tipi di cellule del paziente;

introduzione di geni estranei;

selezione delle cellule in cui il gene estraneo ha “messo radici”;

L'impianto di loro al paziente (ad esempio, attraverso la trasfusione di sangue).

La terapia genica si basa sull'introduzione del DNA clonato nei tessuti del paziente. I vaccini iniettabili e aerosol sono considerati i metodi più efficaci.

La terapia genica funziona in due modi:

1. Trattamento delle malattie monogeniche. Questi includono disturbi nel cervello, che sono associati a qualsiasi danno alle cellule che producono neurotrasmettitori.

2. Trattamento I principali approcci utilizzati in quest'area sono:

· miglioramento genetico delle cellule immunitarie;

aumento dell'immunoreattività tumorale;

blocco di espressione dell'oncogene;

protezione delle cellule sane dalla chemioterapia;

introduzione di geni oncosoppressori;

produzione di sostanze antitumorali da parte delle cellule sane;

produzione di vaccini antitumorali;

riproduzione locale dei tessuti normali con l'aiuto di antiossidanti.

L'uso della terapia genica ha molti vantaggi e in alcuni casi è l'unica possibilità di una vita normale per i malati. Tuttavia, quest'area della scienza non è stata completamente esplorata. C'è un divieto internazionale di test sul sesso e sulle cellule germinali pre-impianto. Questo viene fatto per prevenire costrutti e mutazioni geniche indesiderate.

Sono state sviluppate e generalmente riconosciute alcune condizioni in base alle quali gli studi clinici sono consentiti:

Il gene trasferito alle cellule bersaglio deve essere attivo per molto tempo.

In un ambiente estraneo, il gene deve mantenere la sua efficacia.

Il trasferimento genico non dovrebbe causare reazioni negative nel corpo.

Ci sono una serie di domande che rimangono rilevanti oggi per molti scienziati in tutto il mondo:

Gli scienziati che lavorano nel campo della terapia genica saranno in grado di sviluppare una correzione genetica completa che non rappresenti una minaccia per la prole?

La necessità e il beneficio di una procedura di terapia genica per una singola coppia supereranno il rischio di questo intervento per il futuro dell'umanità?

Procedure simili sono giustificate, visto il futuro?

In che modo tali procedure sull'uomo saranno correlate alle questioni dell'omeostasi della biosfera e della società?

In conclusione, si può notare che la terapia genetica allo stato attuale offre all'umanità modi per curare le malattie più gravi, che fino a poco tempo fa erano considerate incurabili e fatali. Tuttavia, allo stesso tempo, lo sviluppo di questa scienza pone nuovi problemi agli scienziati che devono essere affrontati oggi.

introduzione

Ogni anno compaiono sempre più articoli su riviste scientifiche su studi clinici medici, in cui, in un modo o nell'altro, è stato utilizzato un trattamento basato sull'introduzione di vari geni: la terapia genica. Questa direzione è nata da rami così ben sviluppati della biologia come la genetica molecolare e la biotecnologia.

Spesso, quando i metodi convenzionali (conservatori) sono già stati provati, è la terapia genica che può aiutare i pazienti a sopravvivere e persino a riprendersi completamente. Ad esempio, questo vale per le malattie ereditarie monogeniche, cioè quelle causate da un difetto in un singolo gene, così come molte altre. Oppure, ad esempio, la terapia genica può aiutare e salvare un arto per quei pazienti che hanno ristretto il lume dei vasi negli arti inferiori e, di conseguenza, si è sviluppata un'ischemia persistente dei tessuti circostanti, cioè questi tessuti sperimentano una grave mancanza di nutrienti e ossigeno, che normalmente vengono trasportati dal sangue attraverso il corpo. Spesso è impossibile trattare tali pazienti con manipolazioni chirurgiche e farmaci, ma se le cellule sono costrette localmente a espellere più fattori proteici che influenzerebbero il processo di formazione e germinazione di nuovi vasi, l'ischemia diventerebbe molto meno pronunciata e diventerebbe molto più facile per i pazienti vivere.

terapia genetica oggi può essere definito come il trattamento di malattie mediante l'introduzione di geni nelle cellule dei pazienti con l'obiettivo di colpire i difetti genetici o dare alle cellule nuove funzioni. I primi studi clinici sui metodi di terapia genica sono stati intrapresi solo il 22 maggio 1989 per diagnosticare il cancro. La prima malattia ereditaria per la quale sono stati applicati metodi di terapia genica è stata l'immunodeficienza ereditaria.

Ogni anno, il numero di studi clinici condotti con successo per il trattamento di varie malattie mediante la terapia genica è in aumento e a gennaio 2014 aveva raggiunto i 2.000.

Allo stesso tempo, nella moderna ricerca sulla terapia genica, si deve tenere conto del fatto che le conseguenze della manipolazione dei geni o del DNA "mischiato" (ricombinante) in vivo(lat. letteralmente "vivo") non sono stati studiati abbastanza. Nei paesi con il livello più avanzato di ricerca in questo settore, in particolare negli Stati Uniti, i protocolli medici che utilizzano sequenze di DNA sensoriale sono soggetti a esame obbligatorio nei comitati e commissioni competenti. Negli Stati Uniti si tratta del Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) e della Food and Drug Administration (FDA) con successiva approvazione obbligatoria del progetto da parte del direttore del National Institutes of Health (National Institutes of Health).

Quindi, abbiamo deciso che questo trattamento si basa sul fatto che se alcuni tessuti del corpo mancano di alcuni fattori proteici individuali, allora questo può essere corretto introducendo i geni codificanti proteine ​​​​appropriati in questi tessuti e tutto diventerà più o meno meraviglioso . Le proteine ​​stesse non possono essere iniettate, perché il nostro organismo reagirà immediatamente con una risposta immunitaria non debole, e la durata dell'azione sarebbe insufficiente. Ora dobbiamo decidere il metodo di consegna del gene nelle cellule.

Trasfezione cellule

Per cominciare, vale la pena introdurre le definizioni di alcuni termini.

Il trasporto genico è effettuato da vettoreè una molecola di DNA utilizzata come "veicolo" per il trasferimento artificiale di informazioni genetiche in una cellula. Esistono molti tipi di vettori: plasmide, virale, così come cosmidi, fasmidi, cromosomi artificiali, ecc. È di fondamentale importanza che i vettori (in particolare i vettori plasmidici) abbiano le loro proprietà caratteristiche:

1. Origine della replicazione (ori)- la sequenza nucleotidica in cui inizia la duplicazione del DNA. Se il DNA vettore non può essere duplicato (replicato), allora l'effetto terapeutico necessario non sarà raggiunto, perché sarà semplicemente tagliato rapidamente dagli enzimi nucleasi intracellulari e, a causa della mancanza di stampi, alla fine si formeranno molte meno molecole proteiche. Va notato che questi punti sono specifici per ciascuna specie biologica, cioè se si suppone che il DNA vettore sia ottenuto dalla sua riproduzione in una coltura batterica (e non solo dalla sintesi chimica, che di solito è molto più costosa), allora due i punti di origine della replicazione saranno richiesti separatamente - per l'uomo e per i batteri;

2. Siti di restrizione- brevi sequenze specifiche (solitamente palindromiche), che vengono riconosciute da speciali enzimi (endonucleasi di restrizione) e da essi tagliate in un certo modo - con formazione di "estremità appiccicose" (Fig. 1).

Fig.1 Formazione di "fini appiccicosi" con la partecipazione di restrittivi

Questi siti sono necessari per legare in modo incrociato il DNA vettore (che, di fatto, è un "vuoto") con i geni terapeutici desiderati in un'unica molecola. Tale molecola reticolata da due o più parti è chiamata "ricombinante";

3. È chiaro che vorremmo ottenere milioni di copie della molecola del DNA ricombinante. Ancora una volta, se abbiamo a che fare con una coltura di cellule batteriche, allora questo DNA deve essere ulteriormente isolato. Il problema è che non tutti i batteri ingoieranno la molecola di cui abbiamo bisogno, altri no. Per distinguere tra questi due gruppi, vengono inseriti nel DNA vettore marcatori selettivi- aree di resistenza ad alcune sostanze chimiche; ora, se queste stesse sostanze vengono aggiunte all'ambiente, sopravviveranno solo quelle che sono resistenti e il resto morirà.

Tutti questi tre componenti possono essere osservati nel primissimo plasmide sintetizzato artificialmente (Fig. 2).

Fig.2

Viene chiamato il processo stesso di introduzione di un vettore plasmidico in alcune cellule trasfezione. Un plasmide è una molecola di DNA abbastanza corta e generalmente circolare che si trova nel citoplasma di una cellula batterica. I plasmidi non sono associati al cromosoma batterico, possono replicarsi indipendentemente da esso, possono essere rilasciati dal batterio nell'ambiente o, al contrario, essere assorbiti (il processo di assorbimento è trasformazione). Con l'aiuto dei plasmidi, i batteri possono scambiare informazioni genetiche, ad esempio trasferire la resistenza a determinati antibiotici.

I plasmidi esistono nei batteri in vivo. Ma nessuno può impedire a un ricercatore di sintetizzare artificialmente un plasmide che avrà le proprietà di cui ha bisogno, cucirvi un gene inserto e introdurlo in una cellula. Diversi inserti possono essere inseriti nello stesso plasmide .

Metodi di terapia genica

Esistono due approcci principali che differiscono nella natura delle cellule bersaglio:

1. Fetale, in cui il DNA estraneo viene introdotto nello zigote (uovo fecondato) o nell'embrione in una fase iniziale di sviluppo; in questo caso, si prevede che il materiale introdotto entri in tutte le cellule del ricevente (e anche nelle cellule germinali, garantendo così la trasmissione alla generazione successiva). Nel nostro paese, infatti, è vietato;

2. Somatica, in cui il materiale genetico viene introdotto nelle cellule non sessuali dei già nati e non viene trasmesso alle cellule sessuali.

Terapia genetica in vivo si basa sull'introduzione diretta di sequenze di DNA clonate (moltiplicate) e specificamente confezionate in determinati tessuti del paziente. Particolarmente promettente per il trattamento delle malattie genetiche in vivo è l'introduzione di geni mediante aerosol o vaccini iniettabili. La terapia genica aerosol è in fase di sviluppo, di regola, per il trattamento delle malattie polmonari (fibrosi cistica, cancro ai polmoni).

Lo sviluppo di un programma di terapia genica è preceduto da molte fasi. Ciò include un'analisi approfondita dell'espressione tessuto-specifica del gene corrispondente (cioè la sintesi sulla matrice genica di alcune proteine ​​in un determinato tessuto), l'identificazione del difetto biochimico primario e lo studio della struttura, della funzione e distribuzione intracellulare del suo prodotto proteico, nonché l'analisi biochimica del processo patologico. Tutti questi dati vengono presi in considerazione quando si redige il protocollo medico appropriato.

È importante che quando si elaborano schemi di correzione genica, l'efficienza della trasfezione, il grado di correzione del difetto biochimico primario in condizioni di coltura cellulare ( in vitro,"in vitro") e, soprattutto, in vivo su modelli biologici animali. Solo allora può iniziare il programma di sperimentazione clinica. .

Consegna diretta e vettori cellulari di geni terapeutici

Esistono molti metodi per introdurre DNA estraneo in una cellula eucariotica: alcuni dipendono da processi fisici (elettroporazione, magnetofezione, ecc.), altri dall'uso di materiali chimici o particelle biologiche (es. virus) che vengono utilizzati come vettori. Vale la pena ricordare subito che i metodi chimici e fisici sono solitamente combinati (ad esempio, elettroporazione + avvolgimento del DNA con liposomi)

Metodi diretti

1. La trasfezione a base chimica può essere classificata in diversi tipi: utilizzando sostanza ciclodestrina, polimeri, liposomi o nanoparticelle (con o senza funzionalizzazione chimica o virale, cioè modifica della superficie).
a) Uno dei metodi più economici è l'uso del fosfato di calcio. Aumenta l'efficienza dell'incorporazione del DNA nelle cellule di 10-100 volte. Il DNA forma un forte complesso con il calcio, che ne assicura un efficiente assorbimento. Lo svantaggio è che solo circa l'1 - 10% del DNA raggiunge il nucleo. Metodo utilizzato in vitro trasferire il DNA nelle cellule umane (Fig. 3);

Fig.3

b) L'uso di molecole organiche altamente ramificate - dendrimero, per legare il DNA e trasferirlo alla cellula (Fig. 4);

Fig.4

c) Un metodo molto efficace per la trasfezione del DNA è la sua introduzione attraverso i liposomi - piccoli corpi circondati da membrane che possono fondersi con la membrana citoplasmatica cellulare (CPM), che è un doppio strato di lipidi. Per le cellule eucariotiche, la trasfezione è più efficiente con i liposomi cationici perché le cellule sono più sensibili ad essi. Il processo ha il suo nome: lipofezione. Questo metodo è considerato uno dei più sicuri oggi. I liposomi sono atossici e non immunogenici. Tuttavia, l'efficienza del trasferimento genico mediante liposomi è limitata, poiché il DNA da essi introdotto nelle cellule viene solitamente catturato immediatamente dai lisosomi e distrutto. L'introduzione del DNA nelle cellule umane con l'aiuto dei liposomi è oggi il cardine della terapia. in vivo(fig.5);

Fig.5

d) Un altro metodo è l'uso di polimeri cationici come dietilamminoetil-destrano o polietilenimmina. Le molecole di DNA caricate negativamente si legano ai policationi caricati positivamente e questo complesso entra quindi nella cellula per endocitosi. Il DEAE-destrano modifica le proprietà fisiche della membrana plasmatica e stimola l'assorbimento di questo complesso da parte della cellula. Lo svantaggio principale del metodo è che il DEAE-destrano è tossico ad alte concentrazioni. Il metodo non ha ricevuto distribuzione nella terapia genica;

e) Con l'aiuto di istoni e altre proteine ​​nucleari. Queste proteine, contenenti molti amminoacidi con carica positiva (Lys, Arg), in condizioni naturali aiutano a impacchettare in modo compatto una lunga catena di DNA in un nucleo cellulare relativamente piccolo.

2. Metodi fisici:

a) L'elettroporazione è un metodo molto popolare; l'aumento istantaneo della permeabilità della membrana si ottiene grazie al fatto che le cellule sono soggette a brevi esposizioni a un intenso campo elettrico. È stato dimostrato che in condizioni ottimali il numero di trasformanti può raggiungere l'80% delle cellule sopravvissute. Attualmente non è utilizzato sull'uomo (Fig. 6).

Fig.6

b) "Spremitura cellulare" - un metodo inventato nel 2013. Ti consente di fornire molecole alle cellule "comprimendo delicatamente" la membrana cellulare. Il metodo elimina la possibilità di tossicità o di colpo errato sul bersaglio, in quanto non dipende da materiali esterni o campi elettrici;

c) Sonoporazione - un metodo di trasferimento artificiale di DNA estraneo nelle cellule esponendole agli ultrasuoni, che provoca l'apertura dei pori nella membrana cellulare;
d) Trasfezione ottica - un metodo in cui viene praticato un minuscolo foro nella membrana (circa 1 µm di diametro) utilizzando un laser altamente focalizzato;
e) Trasfezione idrodinamica - un metodo per fornire costrutti genetici, proteine, ecc. da un aumento controllato della pressione nei capillari e nel liquido interstiziale, che provoca un aumento a breve termine della permeabilità delle membrane cellulari e la formazione di pori temporanei in esse. Viene effettuato mediante iniezione rapida nel tessuto, mentre la consegna non è specifica. Efficienza di consegna per il muscolo scheletrico - dal 22 al 60% ;

f) Microiniezione di DNA - introduzione nel nucleo di cellule animali mediante microtubuli di vetro sottili (d=0,1-0,5 µm). Lo svantaggio è la complessità del metodo, la probabilità di distruzione del nucleo o del DNA è alta; un numero limitato di cellule può essere trasformato. Non utilizzato per l'uomo.

3. Metodi basati su particelle.

a) Un approccio diretto alla trasfezione è il gene gun, in cui il DNA è accoppiato in una nanoparticella con solidi inerti (solitamente oro, tungsteno), che poi "spara" diretti ai nuclei delle cellule bersaglio. Questo metodo viene applicato in vitro e in vivo per l'introduzione di geni, in particolare, nelle cellule dei tessuti muscolari, ad esempio in una malattia come la distrofia muscolare di Duchenne. La dimensione delle particelle d'oro è di 1-3 micron (Fig. 7).

Fig.7

b) Magnetofezione - un metodo che utilizza le forze del magnetismo per fornire il DNA alle cellule bersaglio. In primo luogo, gli acidi nucleici (NA) sono associati a nanoparticelle magnetiche e quindi, sotto l'azione di un campo magnetico, le particelle vengono spinte nella cellula. L'efficienza è quasi del 100%, si nota un'evidente non tossicità. Già dopo 10-15 minuti, le particelle vengono registrate nella cella: questo è molto più veloce di altri metodi.
c) Impalefection (impalefection; "impalement", lett. "impaling" + "infezione") - un metodo di consegna che utilizza nanomateriali come nanotubi di carbonio e nanofibre. In questo caso, le cellule vengono letteralmente trafitte da un letto di nanofibrille. Il prefisso "nano" è usato per denotare le loro dimensioni molto ridotte (entro miliardesimi di metro) (Fig. 8).

Fig.8

Separatamente, vale la pena evidenziare un metodo come la trasfezione dell'RNA: non il DNA viene consegnato alla cellula, ma le molecole di RNA - i loro "successori" nella catena di biosintesi delle proteine; allo stesso tempo, vengono attivate proteine ​​speciali che tagliano l'RNA in brevi frammenti, i cosiddetti. piccolo RNA interferente (siRNA). Questi frammenti si legano ad altre proteine ​​e, alla fine, questo porta all'inibizione dell'espressione dei geni corrispondenti da parte della cellula. Pertanto, è possibile bloccare l'azione di quei geni nella cellula che potenzialmente fanno più male che bene al momento. La trasfezione dell'RNA ha trovato ampia applicazione, in particolare, in oncologia.

Vengono presi in considerazione i principi di base della consegna del gene utilizzando vettori plasmidici. Ora possiamo passare alla considerazione dei metodi virali. I virus sono forme di vita non cellulari, il più delle volte una molecola di acido nucleico (DNA o RNA) avvolta in un guscio proteico. Se eliminiamo dal materiale genetico del virus tutte quelle sequenze che causano l'insorgenza di malattie, allora anche l'intero virus può essere trasformato con successo in un "veicolo" per il nostro gene.

Viene chiamato il processo di introduzione del DNA in una cellula, mediato da un virus trasduzione.
In pratica, sono più comunemente usati retrovirus, adenovirus e virus adeno-associati (AAV). Per cominciare, vale la pena capire quale dovrebbe essere il candidato ideale per la trasduzione tra virus. I criteri sono che deve essere:

stabile;
. capacità, cioè di contenere una quantità sufficiente di DNA;
. inerte rispetto alle vie metaboliche della cellula;
. accurato - idealmente, dovrebbe integrare il suo genoma in un locus specifico del genoma del nucleo ospite, ecc.

Nella vita reale è molto difficile combinare almeno alcuni punti, tanto che di solito la scelta avviene quando si considera ogni singolo caso separatamente (Fig. 9).

Fig.9

Dei tre virus più utilizzati elencati, AAV è il più sicuro e allo stesso tempo il più accurato. Quasi il loro unico inconveniente è la loro capacità relativamente piccola (circa 4800 bp), che però risulta essere sufficiente per molti geni .

Oltre ai metodi di cui sopra, la terapia genica viene spesso utilizzata in combinazione con la terapia cellulare: in primo luogo, una coltura di alcune cellule umane viene piantata in un mezzo nutritivo, quindi i geni necessari vengono introdotti nelle cellule in un modo o nell'altro, coltivati ​​per qualche tempo e trapiantato nuovamente nell'organismo ospite. Di conseguenza, le cellule possono tornare alle loro normali proprietà. Quindi, ad esempio, i globuli bianchi umani (leucociti) sono stati modificati nella leucemia (Fig. 10).

Fig.10

Il destino del gene dopo che è entrato nella cellula

Poiché tutto è più o meno chiaro con i vettori virali a causa della loro capacità di consegnare i geni in modo più efficiente al bersaglio finale - il nucleo, ci soffermeremo sul destino del vettore plasmidico.

In questa fase, abbiamo ottenuto che il DNA abbia superato la prima grande barriera: la membrana citoplasmatica della cellula.

Inoltre, in combinazione con altre sostanze, con o senza guscio, deve raggiungere il nucleo cellulare in modo che uno speciale enzima - l'RNA polimerasi - sintetizzi una molecola di RNA messaggero (mRNA) su un modello di DNA (questo processo è chiamato trascrizione). Solo dopo, l'mRNA entrerà nel citoplasma, formerà un complesso con i ribosomi e, secondo il codice genetico, viene sintetizzato un polipeptide, ad esempio il fattore di crescita vascolare (VEGF), che inizierà a svolgere una certa funzione terapeutica ( in questo caso si avvierà la formazione di ramificazioni vascolari nei tessuti inclini ad ischemia).

Per quanto riguarda l'espressione dei geni introdotti nel tipo cellulare desiderato, questo problema viene risolto con l'ausilio di elementi regolatori trascrizionali. Il tessuto in cui si verifica l'espressione è spesso determinato dalla combinazione di un potenziatore tessuto-specifico (sequenza "enhancing") con un particolare promotore (sequenza nucleotidica da cui l'RNA polimerasi inizia la sintesi), che può essere inducibile. . È noto che l'attività genica può essere modulata in vivo segnali esterni e poiché i potenziatori possono funzionare con qualsiasi gene, gli isolanti possono anche essere introdotti nei vettori, che aiutano il potenziatore a funzionare indipendentemente dalla sua posizione e possono comportarsi come barriere funzionali tra i geni. Ciascun potenziatore contiene una serie di siti di legame per l'attivazione o la soppressione di fattori proteici. I promotori possono anche regolare il livello di espressione genica. Ad esempio, ci sono metallotioneina o promotori termosensibili; promotori ormonali.

L'espressione di un gene dipende dalla sua posizione nel genoma. Nella maggior parte dei casi, i metodi virali esistenti portano solo all'inserimento casuale di un gene nel genoma. Per eliminare tale dipendenza, durante la costruzione di vettori, il gene è dotato di sequenze nucleotidiche note che consentono al gene di essere espresso indipendentemente dal suo sito di inserimento nel genoma.

Il modo più semplice per regolare l'espressione del transgene è fornirgli un promotore indicatore sensibile a un segnale fisiologico come il rilascio di glucosio o l'ipossia. Tali sistemi di controllo "endogeni" possono essere utili in alcune situazioni, come il controllo glucosio-dipendente della produzione di insulina. Più affidabili e versatili sono i sistemi di controllo "esogeni", quando l'espressione genica è controllata farmacologicamente mediante l'introduzione di una piccola molecola di farmaco. Attualmente sono noti 4 principali sistemi di controllo - regolati dalla tetraciclina (Tet), uno steroide insetto, ecdisone o suoi analoghi, il farmaco antiprogestinico maifpristone (RU486) e dimerizzatori chimici come la rapamicina e suoi analoghi. Tutti includono il reclutamento farmaco-dipendente del dominio di attivazione della trascrizione al principale promotore che guida il gene desiderato, ma differiscono nei meccanismi di questo reclutamento. .

Conclusione

Una revisione dei dati porta alla conclusione che, nonostante gli sforzi di molti laboratori nel mondo, tutti già conosciuti e testati in vivo e in vitro i sistemi vettoriali sono tutt'altro che perfetti . Se il problema della consegna di DNA estraneo in vitro praticamente risolto e la sua consegna a cellule bersaglio di diversi tessuti in vivo risolto con successo (principalmente creando costrutti che trasportano proteine ​​​​recettrici, inclusi antigeni specifici di determinati tessuti), quindi altre caratteristiche dei sistemi vettoriali esistenti - stabilità dell'integrazione, espressione regolata, sicurezza - necessitano ancora di seri miglioramenti.

In primo luogo, riguarda la stabilità dell'integrazione. Finora, l'integrazione nel genoma è stata ottenuta solo utilizzando vettori retrovirali o adeno-associati. L'efficienza dell'integrazione stabile può essere aumentata migliorando i costrutti genici come i sistemi mediati da recettori o creando vettori episomiali sufficientemente stabili (cioè strutture di DNA in grado di risiedere a lungo termine all'interno dei nuclei). Di recente, è stata prestata particolare attenzione alla creazione di vettori basati sui cromosomi artificiali dei mammiferi. A causa della presenza degli elementi strutturali di base dei cromosomi ordinari, tali mini-cromosomi vengono trattenuti nelle cellule per lungo tempo e sono in grado di trasportare geni (genomici) a grandezza naturale e i loro elementi regolatori naturali, necessari per il corretto funzionamento del gene, nel tessuto giusto e al momento giusto.

La terapia genica e cellulare apre brillanti prospettive per il ripristino di cellule e tessuti perduti e per la progettazione ingegneristica genetica degli organi, che senza dubbio amplieranno in modo significativo l'arsenale di metodi per la ricerca biomedica e creeranno nuove opportunità per preservare e prolungare la vita umana.