Sindrome di Martin-Bell: sviluppo, sintomi e segni, diagnosi, trattamento, prognosi. Sindrome dell'X fragile Altri problemi di salute associati alla sindrome di Martin-Bell

Studio del polimorfismo della ripetizione CGG nel gene FMR1 (associato al trasporto di premutazioni della sindrome dell'X fragile (cromosoma X fragile))

• La sindrome di Martin-Bell (sindrome del cromosoma X fragile, sindrome da ritardo mentale X fragile, FraX (dall'inglese fragile - fragile, fragile)) è una malattia ereditaria caratterizzata da caratteristiche fisiche, comportamentali ed emotive, difficoltà di apprendimento. Questa condizione si verifica in 1 su 4000 ragazzi e 1 su 5000-8000 ragazze.
• Questa condizione si sviluppa a causa di cambiamenti nel gene FMR1 ("Fragile X Mental Retardation 1) e, di conseguenza, nell'omonima proteina cerebrale FMRP. Questo gene si trova sul cromosoma X. Le ragazze hanno due copie del cromosoma X e i ragazzi ne hanno una X e una Y. Il cambiamento nel gene si esprime nella ripetizione ripetuta di una delle parti del gene (la tripletta CGG). La maggior parte delle persone ha poche ripetizioni, tra 6 e 50 volte, con una media di 30, che di solito non causano un cromosoma X fragile.
• Con un numero medio di ripetizioni (da 50 a 200 volte) si sviluppa, si parla di carrozza premutazioni. In questo caso il gene continua a funzionare, la sindrome dell'X fragile non si sviluppa e l'attività mentale non risente, ma c'è il rischio di sviluppare disturbi neurologici all'età di 50 anni e il rischio di sviluppare un'insufficienza ovarica prematura (menopausa precoce (menopausa ) e infertilità). Queste condizioni sono chiamate sindrome da tremore/atassia associata all'X fragile (FXTAS) e insufficienza ovarica primaria associata all'X fragile (FXPOI).
• Da 40 a 55 ripetizioni è una "zona grigia" in cui la variante normale e la premutazione si sovrappongono.
• Quando il numero di ripetizioni è troppo alto, più di 200, il gene è danneggiato, questo viene chiamato mutazione completa. Negli uomini, poiché esiste un solo cromosoma X, si sviluppa la sindrome dell'X fragile. La donna sarà portatrice del fragile cromosoma X. Le manifestazioni della sindrome possono essere, dipende dall'attività del gene FMR1.
• L'eredità di questo stato è legata all'X. Cioè, dalla madre a qualsiasi figlio e dal padre - uniche figlie. La dimensione della sequenza di ripetizioni può aumentare con l'ereditarietà: ad esempio, una madre o un padre con una premutazione possono avere un figlio con una mutazione completa. Quindi, se la madre ha la premutazione e il padre non ha la mutazione del cromosoma X, ad ogni gravidanza i loro figli hanno una probabilità su 2 che il gene difettoso venga ereditato e si sviluppi la sindrome dell'X fragile. Per una figlia - una percentuale simile dell'opportunità di ereditare il gene difettoso.
• I test genetici consentono di determinare il trasporto di un gene con una premutazione o una mutazione completa. Il metodo diagnostico principale è la PCR (reazione a catena della polimerasi).

Cambiamenti del gene FMR1

I nostri cromosomi sono lunghi filamenti di DNA su cui sono isolati i geni. Le informazioni nel gene sono scritte sotto forma di un codice genetico con 4 lettere: A, T, G, C. Queste lettere denotano i componenti semplici del DNA. Ogni gene è costituito da una stringa di "parole in codice", ciascuna delle quali è composta da 3 lettere. Ogni parola è chiamata terzina. In alcuni geni, queste triplette si ripetono più volte. La tripletta, ripetuta nel gene FMR1, è composta da tre lettere: CGG (CGG). Quando il numero di ripetizioni di una tripletta diventa troppo alto, il gene diventa così lungo da diventare difettoso.

Il numero di ripetizioni della tripletta CGG crea una lunghezza diversa della regione di ripetizione nel gene FMR1.

Ripetere la lunghezza.	Influenza
Gene corto (6-50 ripetizioni)	Non influisce
Lunghezza media (50-200 ripetizioni) Premutazione	Uomini e donne sono portatori. La sindrome di atassia può svilupparsi (più spesso negli uomini di età superiore a 79 anni), nelle donne - insufficienza ovarica prematura primaria(nel 20% delle donne).
Gene lungo (più di 200 ripetizioni) Mutazione completa	Uomini ha la sindrome dell'X fragile, che si esprime in ritardo dello sviluppo, fisico, linguaggio, coordinazione; problemi comportamentali ed emotivi, tra cui una ridotta coordinazione dell'attenzione, disturbi del linguaggio, problemi sensoriali, sbalzi d'umore con attacchi di aggressività e depressione. Possono svilupparsi epilessia, problemi cardiaci, infezioni ricorrenti dell'orecchio e problemi agli occhi. Aspetto: orecchie grandi e sporgenti, viso allungato, testicoli grandi, fronte alta e larga, punta del naso leggermente a forma di becco, palato alto arcuato e problemi al tessuto connettivo (piedi piatti, scoliosi, ipermobilità articolare).
	Donne saranno portatori del fragile cromosoma X con la possibilità di trasmettere questa mutazione alla loro prole. Le donne di solito non hanno manifestazioni così vivide. Circa il 60% presenta disturbi mentali di moderata gravità, iperattività o, al contrario, timidezza. Si possono osservare cambiamenti nelle sfere comportamentali ed emotive simili a quelle degli uomini. La variabilità nelle manifestazioni della presenza di un cromosoma X fragile è spiegata dal sistema di spegnimento o inattivazione di uno dei due cromosomi X nella cellula. Ciò significa che nelle donne, come negli uomini, solo uno dei cromosomi X nella cellula funziona, il secondo è inattivo. Quale funziona e quale no è un processo casuale. Quindi, metà delle cellule avrà un cromosoma X funzionante senza una mutazione e l'altra metà avrà una mutazione. Tuttavia, questo di solito è sufficiente per la normale funzione genica e un'adeguata produzione della proteina importante per il cervello, FMRP. La gravità delle manifestazioni dipende dalla proporzione di cellule che trasportano il gene difettoso.

Sfondo

All'inizio del secolo, gli scienziati hanno notato la predominanza del ritardo mentale nei maschi. Per la prima volta nel 1934, J. Martin e Julia Bell descrissero una famiglia in cui il ritardo mentale era ereditato come un tipo legato al sesso. In questa famiglia inglese c'erano 11 uomini con ritardo mentale e 2 donne con un lieve grado di ritardo mentale. Inoltre, tali famiglie venivano descritte sempre di più.

Tra il gruppo delle malattie ereditarie, ci sono due malattie legate a le cause più comuni di disabilità intellettiva. La patologia più famosa e comune è la sindrome di Down, associata alla presenza di un 21° cromosoma in più nel genoma umano. In questo articolo parleremo della seconda malattia ereditaria più comune che porta al ritardo mentale e può anche essere accompagnata da altre manifestazioni cliniche.

Sindrome dell'X fragile o la sindrome di Martin-Bell è il risultato di un disturbo in gene FMR1 (ritardo mentale X fragile-1), che si trova sul cromosoma X e svolge un ruolo importante nell'emergere e nello sviluppo delle connessioni neurali, dell'apprendimento e della memorizzazione. La frequenza di questa sindrome tra i ragazzi è 1:4000.

La cosiddetta "fragilità" del cromosoma X si manifesta nel fatto che il cromosoma appare atipico con una colorazione speciale, come se un pezzo si fosse separato, sebbene fisicamente rimanga intatto. La base genetica di questo fenomeno è un aumento del numero di trinucleotidi ripetizioniCGG nel gene FMR1 situato sul cromosoma X.

Nelle persone sane, il numero di ripetizioni in questo gene oscilla. da 5 a54 . Se ripetizioni più di 200, quindi la produzione di proteine ​​dal gene FMR1 è disturbato, il che porta allo sviluppo della sindrome di Martin-Bell e alla manifestazione clinica della malattia. stato premutazionaleè il numero di ripetizioni CGG da 55 a 200. In questa condizione, la malattia negli esseri umani non si manifesta in genere, ma più ripetizioni in questo gene ha il portatore, più è probabile che i suoi figli abbiano un conteggio delle ripetizioni di oltre 200 e la malattia si svilupperà. Nel caso di un portatore di una premutazione durante la formazione delle cellule germinali, il numero di ripetizioni può aumentare, quindi, se il genitore ha un numero di ripetizioni da 55 a 200, allora la probabilità di avere un figlio con un gene mutante è alto. FMR1 e la sindrome di Martin-Bell. Allo stesso tempo, il trasporto dello stato premutazionale da parte del futuro padre e madre non è equivalente in termini di probabilità che si verifichi l'allele mutante nei loro figli: se la madre è la portatrice, allora la probabilità di un aumento significativo nel numero di ripetizioni è molto più alto. Il numero di ripetizioni da 45 a 54 è una forma intermedia che non ha alcun effetto sulla salute umana, ma può portare a problemi nelle generazioni future, come nel caso di uno stato premutazionale del gene.

È importante tenerne conto l'eredità e lo sviluppo della malattia dipendono dal sesso, poiché il gene FMR1 si trova sul cromosoma X. Gli uomini hanno un solo cromosoma X, che ricevono dalla madre. Pertanto, se questo cromosoma si è rivelato "fragile", hanno una malattia. Le donne hanno due cromosomi X, ma solo uno di essi è attivo. Pertanto, la presenza di un cromosoma X con un gene mutato FMR1 può non manifestarsi clinicamente, nel caso di inattivazione del cromosoma “fragile”, o portare allo sviluppo della malattia nel 30-50% dei casi. Un uomo con un cromosoma X fragile può trasmetterlo a tutte le sue figlie, ma non a nessuno dei suoi figli. Una donna con un cromosoma mutante ha la possibilità di trasmetterlo a figli e figlie con uguale probabilità.

Stato premutazionale di un gene colpisce sia il destino dei discendenti del portatore di un tale gene, sia direttamente sulla sua salute:

Sviluppo insufficienza ovarica primaria (FXPOI) (diminuzione della riserva ovarica e inizio della menopausa prima dei 40 anni). Mutazione FMR1 è la causa dell'insufficienza ovarica prematura nel 5% delle donne con questa diagnosi. Tra i portatori della premutazione, circa un quarto sviluppa questa condizione. Colpisce non solo le possibilità riproduttive generali, ma anche la selezione del protocollo di stimolazione per l'ART, poiché spesso provoca una scarsa risposta ovarica alla stimolazione. È interessante notare che, secondo i dati Genetico, sebbene la scarsa risposta ovarica alla stimolazione influisca sul numero di embrioni prodotti per ciclo, non porta ad un aumento della proporzione di embrioni aneuploidi.

Tremore/atassia associato al fragile cromosoma X ( FXTAS). Questa condizione si sviluppa più spesso negli uomini: quando la premutazione è portata da un uomo, si manifesta nel 33% dei casi e quando la premutazione è portata da una donna - solo nel 5-10%. La sindrome FXTAS inizia a manifestarsi in età avanzata. C'è un tremore, un'andatura traballante, la parola può soffrire.

Il metodo diagnostico utilizzato nel laboratorio Genetico si basa sull'uso di una reazione a catena della polimerasi con uno speciale set di primer, che consente non solo di rilevare stati normali, premutazionali e mutazionali, ma anche determinare con precisione il numero di ripetizioni nei casi in cui sono meno di 200. Tale diagnosi consente di identificare la sindrome dell'X fragile a livello molecolare, nonché di valutare la probabilità di avere un figlio con questa sindrome e la possibilità che il paziente sviluppi disturbi associati con un numero maggiore di ripetizioni nel gene FMR1 . Questa diagnosi consente anche rilevare la presenza di ripetizioni AGG tra le ripetizioni CGG. Si ritiene che le regioni AGG che interrompono una lunga sequenza di ripetizioni CGG conferiscano stabilità al DNA e riducano il rischio di un aumento del numero di ripetizioni nella generazione successiva.

Test genetico che determina il numero di ripetizioni in un gene FMR1 , consigliato passa il Prima di tutto donne con sindrome da insufficienza ovarica prematura o con inattivazione non casuale identificata del cromosoma X (segno indiretto), famiglie con figli con disabilità intellettiva. Anche analisi dello stato geneticoFMR 1 necessario:

1)donne con problemi riproduttivi o problemi di fertilità associati a livelli elevati di ormone follicolo-stimolante (FSH)

2)pazienti con disabilità intellettiva e i loro parenti

3) quelli che hanno Anamnesi familiare di sindrome dell'X fragile o ritardo mentale senza una diagnosi definitiva

4)donne i cui parenti avevano disturbi associati stato premutazionale FMR1

5)pazienti con esordio tardivo tremore e atassia cerebellare(violazioni della coordinazione del lavoro muscolare dovute a danni ai sistemi cerebrali che controllano il movimento muscolare).

In caso di rilevamento portatore di mutazione asintomatica nel gene FMR1 in una donna può essere raccomandato l'uso di ovociti da donatore o la diagnosi genetica preimpianto (PGD) per escludere la possibilità di una manifestazione della sindrome in un bambino. È anche importante valutare correttamente il rischio di avere un figlio malato in caso di stato premutazionale di un geneFMR 1 dai futuri genitori. In questo caso, in base ai risultati del test, si consiglia di consultare un genetista.

Stagista laboratorio genetico

La malattia è stata descritta per la prima volta nel 1943. Questa è la sindrome più comune, accompagnata da ritardo mentale negli uomini. La sua frequenza in varie popolazioni varia da 16 a 25 per 100.000 maschi.

Il principale fattore eziologico della malattia, identificato nel 99% dei pazienti, è un aumento del numero di ripetizioni CGG trinucleotidiche nella regione non tradotta del primo esone del gene FMR 1, che contiene 17 esoni ed è localizzato su Xq27. cromosoma 3. Questa ripetizione estesa si trova a 250 bp distalmente all'isola CpG. Tutti gli elementi necessari per la normale espressione genica si trovano all'interno di una regione cromosomica di 2,8 kb che copre la regione di 5" del primo esone contenente ripetizioni CGG. Il numero di tali ripetizioni in individui sani può variare da 6 a 200. Il verificarsi di una mutazione in un gene è un processo in due fasi. Nella prima fase, il numero di ripetizioni aumenta a un livello superiore a quello critico per questa popolazione. Questa condizione è definita premutazione. Nel caso di SM B, una premutazione è considerato il numero di ripetizioni superiore a 56. Una mutazione completa è caratterizzata dalla presenza di 200 e più delle ripetizioni trinucleotidiche. I portatori di remutazione hanno un rischio maggiore di dare alla luce un bambino malato con una mutazione completa nel gene, portando alla comparsa di segni clinici di MPS.Va notato che il passaggio di una premutazione genica a una mutazione completa in questa malattia si verifica solo nella meiosi femminile.In questo caso, il livello di espansione ripetuta dipende dal sesso del prole - è notevolmente più alto nei figli che nelle figlie delle donne portatrici. Come spiegazione di questo fenomeno, viene considerata la possibilità di interazione nello zigote dei geni FMR I normali e mutanti di due cromosomi X. Finora non è chiara la causa del fenomeno di espansione delle ripetizioni CGG nel gene FMR 1. Si presume l'esistenza di diversi meccanismi: crossover ineguale, ricombinazione anormale del vlocus del cromosoma X contenente il gene FMRU, nonché la perdita di triplette AGG non omologhe, che normalmente condividono una catena di ripetizioni monotone. Un aumento del numero di ripetizioni CGG al di sopra di un certo livello si verifica vicino alle isole CpG, che porta all'ipermetilazione dell'intera regione regolatoria satura di GC del gene e provoca un blocco completo della sua trascrizione a causa della soppressione del suo promotore. Viene descritta una variante a mosaico di SMB, il cui aspetto è associato all'espansione delle ripetizioni CGG in un clone di piccole cellule. Pertanto, la patogenesi della malattia ha diversi collegamenti:

1) espansione della ripetizione trinucleotidica CGG nel primo esone del gene;

2) eccessiva metilazione dell'isola CpG di questo gene;

3) soppressione dell'espressione del prodotto proteico del gene.

Insieme a questo, è stata rivelata l'eterogeneità genetica di MPS associata sia al polilocus che al poliallelismo. È stata dimostrata l'esistenza di varianti alleliche della malattia causate dalla presenza di mutazioni puntiformi e delezioni del gene FMRL Inoltre, nei pazienti con manifestazioni cliniche di MBS, sono stati trovati altri due siti fragili sensibili ai folati nel cromosoma X, localizzato a una distanza di 300 bp. e 1,5-2 milioni di bp. da un noto sito fragile contenente il gene FMR1. Il meccanismo delle mutazioni in due geni identificati in questi siti fragili e designati FRAXE e FRAXF è simile a quello della forma classica di MPS ed è dovuto all'espansione delle ripetizioni GCC e CGG con la metilazione delle isole CpG. La differenza tra due rare varianti di SMB da quella classica è un aumento del numero di ripetizioni trinucleotidiche, sia nella meiosi femminile che maschile.

È stato dimostrato che il principale meccanismo patogenetico della variante classica della malattia è l'assenza della proteina nucleocitoplasmatica FMR1 (dall'inglese fragile menral retardation), che svolge una funzione di navetta e si lega a vari mRNA. In particolare, questa proteina è coinvolta nella formazione del complesso necessario per l'implementazione dei processi di traduzione nei ribosomi.

Le manifestazioni cliniche della malattia sono caratterizzate da una triade di segni:

1) oligofrenia (il QI dei pazienti è 35-50);

2) dismorfia (prognatismo, padiglioni auricolari sporgenti);

3) macroorchidismo rilevato dopo la pubertà.

Il prolasso della valvola mitrale si riscontra nell'80% dei pazienti. Tuttavia, la forma completa di MPS si verifica solo nel 60% delle persone colpite, nel 10% dei pazienti viene rilevato solo un ritardo mentale, in altri casi c'è una diversa combinazione di sintomi.

Il tipo di ereditarietà di questa malattia è il più vicino alla dominante legata all'X, tuttavia ha una serie di caratteristiche, denominate paradosso di Sherman. Sta nel fatto che la probabilità di sviluppare il sintomo principale della malattia

Ritardo mentale - dipende dalla posizione dell'individuo nel pedigree. Lo illustriamo con l'esempio del pedigree mostrato in figura. Quando si analizza il pedigree, diventa ovvio che l'aspetto della malattia nei membri della terza generazione è difficile da interpretare in termini di un tipo di eredità monogenica. Questo fenomeno è stato spiegato dopo un esame genetico molecolare di tutti i membri del pedigree e la determinazione dei loro genotipi. È stato dimostrato che sono portatore di una premutazione nel gene FMRJ, che lo ha trasmesso alle sue figlie II2 e II4. Le donne che portano la premutazione sono sane, ma hanno un alto rischio di avere un figlio con MBS. In questo caso possono essere colpiti bambini di entrambi i sessi. Ciò può essere dovuto a due meccanismi. Il più probabile è un aumento del numero di ripetizioni trinucleotidiche nella meiosi delle cellule germinali femminili, caratteristica di questa malattia. In questo caso, la probabilità che una premutazione si trasformi in una mutazione dipende dal numero di ripetizioni CGG nel gene FMRi. Nella tabella è presentato il rischio di avere un figlio con CMS portatore della premutazione.

È stato anche dimostrato che solo il 50% di tutte le donne portatrici della mutazione completa ha un ritardo mentale di gravità variabile. Le differenze nelle manifestazioni cliniche nelle donne possono essere dovute al fenomeno della lionizzazione sbilanciata del cromosoma X di origine materna e paterna in varie cellule del corpo. È necessario annotare un'altra caratteristica della manifestazione di questa malattia. È stato dimostrato che anche in presenza di una mutazione completa del gene, il 20% degli uomini non presenta sintomi della malattia.

La diagnosi della malattia può essere effettuata utilizzando vari metodi. Fino a quando non sono state chiarite le basi genetiche molecolari di questa patologia, la diagnosi clinica di MMS è stata confermata esclusivamente con metodi citogenetici. Era noto che nella maggior parte dei pazienti, quando le cellule venivano coltivate in un mezzo con carenza di folati, sul carsogramma veniva rivelato il fenomeno della "fragilità" del cromosoma X nel 27° segmento del suo braccio lungo. Negli ultimi anni sono stati sviluppati metodi genetici molecolari semplici ed economici per diagnosticare l'MMS. Si basano sull'analisi della metilazione delle isole CpG adiacenti a FRAXA, FRAXE e FRAXF in una reazione selettiva a catena della polimerasi. In alcuni casi, per l'analisi simultanea dello stato di metilazione delle isole CpG e l'espansione delle ripetizioni, i campioni di DNA di un paziente vengono trattati con l'enzima di restrizione EcoR1 e quindi con un enzima di restrizione sensibile alla metilazione, di cui uno dei siti di riconoscimento è situato nella regione del promotore del gene. Utilizzando questo metodo, è possibile diagnosticare oltre il 98% dei pazienti con mutazioni complete metilate nel gene FMR1. Il terzo approccio alla diagnosi di MPS è immunochimico; i metodi di immunochimica determinano il livello del prodotto proteico del gene FMRI nei tessuti umani,

Attualmente, grazie ai metodi di genetica molecolare, è diventata possibile una prevenzione efficace dei casi ricorrenti della malattia nelle famiglie gravate. L'analisi molecolare consente di diagnosticare la MBS non solo in presenza di manifestazioni cliniche di malattie, ma anche di identificare i portatori della "premutazione" tra i parenti dei pazienti.

Questa è una delle forme più comuni di ritardo mentale dopo la malattia di Down. Frequenza di popolazione 1:2000 - 1:2500 nati. I ragazzi malati sono 2-3 volte di più delle ragazze e si ammalano più gravemente.

L'aspetto dei pazienti non è sempre specifico. Caratterizzato da viso allungato, fronte alta e sporgente, macro e dolicocefalia, ipoplasia della parte mediana del viso. Le labbra sono spesse, il labbro inferiore è spesso rovesciato. Caratterizzato da macroozia, mani e piedi grandi. Un sintomo tipico - il macroorchidismo - compare negli adolescenti. I testicoli sono ingranditi a causa dello sviluppo del tessuto connettivo. L'attività sessuale è minima. Ci sono sintomi di displasia congenita del tessuto connettivo: debolezza dei legamenti delle articolazioni, piedi piatti, a volte deformità spinale, ecc.

Il ritardo mentale è spesso moderato, raramente profondo (10-15%). La maggior parte dei pazienti è socialmente adattata e può svolgere un semplice lavoro fisico. Le donne portatrici hanno un QI inferiore.

La malattia è causata da una mutazione del gene FMR-1 (ritardo mentale fragile), che è localizzato nel braccio lungo del cromosoma X (Xq). Il gene patologico ha un gran numero di ripetizioni trinucleotidiche (CHR) nella regione 5 1 - non tradotta di questo gene. Normalmente, il numero di ripetizioni va da 6 a 42. Un cromosoma con 50-200 ripetizioni è considerato una premutazione. Nella generazione successiva, il numero di ripetizioni può aumentare fino a 1000, il che porta a un quadro clinico pronunciato. Il quadro clinico dipende dal numero di ripetizioni.

Se una donna ha ereditato un gran numero di ripetizioni, anche lei si ammalerà. Ma questo è raro.

Il metodo diagnostico principale è il cariotipo. I linfociti del paziente vengono coltivati ​​in un mezzo senza acido folico. Nel braccio lungo del cromosoma X si trova un "fragile" ("regione fragile"). Esternamente, assomiglia a una costrizione secondaria e a un satellite. Il cromosoma è danneggiato nell'area di un gran numero di ripetizioni trinucleotidiche.

La diagnosi genetica molecolare è possibile, sono stati sviluppati metodi di diagnosi prenatale.

Diabete fosfato (ipofosfatemia)

Tipo di eredità X-linked dominante. Il gene è localizzato Xp 22.2 - p 22.I.

L'ipofosfatemia può essere rilevata immediatamente dopo la nascita e i segni di rachitismo compaiono alla fine del primo - inizio del secondo anno di vita, quando i bambini iniziano a camminare. Cambiamenti più pronunciati negli arti inferiori: curvatura in varo delle ossa tubolari lunghe. Caratterizzato da bassa statura, mobilità limitata nelle grandi articolazioni (anca, ginocchio, gomito), dolicocefalia, displasia ungueale. L'andatura è incerta, nei casi più gravi i pazienti non possono camminare affatto. A differenza del rachitismo carente di vitamina D, le condizioni generali non sono disturbate. Nelle donne, i disturbi scheletrici sono meno pronunciati. Vengono rivelati i cambiamenti radiologici tipici del rachitismo: la struttura fibrosa grossolana della sostanza ossea spugnosa. Il livello di fosfatasi alcalina nel sangue è aumentato, il livello di calcio è normale. La malattia è causata da una diminuzione del riassorbimento dei fosfati nei tubuli renali.

Malattie ereditarie legate al cromosoma X.

Biologia molecolare in medicina: la scienza dà una possibilità

Mezzo secolo fa, la biologia molecolare sorse e iniziò a svilupparsi rapidamente. Biologi e fisici (unione comune per la metà del XX secolo) scoprirono i più importanti processi cellulari, inventarono i metodi principali, senza i quali il lavoro di un qualsiasi laboratorio biologico è oggi impensabile. Ora abbiamo un enorme potenziale per risolvere vari problemi: chiarire aspetti dell'origine della vita, studiare le interazioni dei componenti in una cellula vivente e complesse cascate biochimiche. Sappiamo e siamo in grado di fare ciò che anche 60 anni fa sembrava fantastico. E uno dei compiti su cui gli scienziati possono già invadere è la lotta contro le malattie ereditarie umane. Alcuni di essi, come la fenilchetonuria, sono stati corretti con successo e molti altri devono ancora essere trovati. Questo articolo discuterà di una di queste malattie - la sindrome dell'X fragile - e delle difficoltà di studiarla.

All'inizio del 20° secolo, gli scienziati hanno notato che il ritardo mentale colpisce più spesso gli uomini. Nel 1934, il medico irlandese James Martin e la genetista inglese Julia Bell descrissero per la prima volta una famiglia in cui il ritardo mentale era ereditato in modo legato al sesso. In questa famiglia c'erano 11 uomini oligofrenici e due donne con un lieve grado di ritardo mentale. La forma familiare scoperta della malattia è stata chiamata sindrome di Martin-Bell. 35 anni dopo, Herbert Labs, conducendo uno studio citogenetico, rivelò nel cariotipo di quattro uomini dementi e tre donne normali (di tre generazioni della stessa famiglia) uno strano cromosoma X, che chiamò marcatore: verso la fine del lungo braccio, aveva una costrizione secondaria. I laboratori hanno proposto di tracciare il cromosoma marcatore negli embrioni maschili in famiglie con sindrome di Martin-Bell disfunzionale, poiché può segnalare un alto rischio di dare alla luce oligofrenici (Fig. 1). Pertanto, i medici hanno ottenuto il primo marker prenatale della sindrome e le loro pazienti l'opportunità di prendere una decisione informata sul mantenimento di una gravidanza. La costrizione del marker è stata localizzata nella regione Xq27.3.

Figura 1. Herbert Labs parla ai colleghi della costrizione del cromosoma X nella sindrome di Martin-Bell. Qui e sotto i disegni dell'autore dell'articolo.

Successivamente, molti ricercatori hanno osservato al microscopio i cromosomi X non solo con una costrizione, ma come se fossero rotti - con le punte delle lunghe braccia "strappate". Il sito di costrizione/rottura è diventato noto come il sito fragile. Pertanto, la malattia ha ricevuto un nome diverso: sindrome dell'X fragile (sindrome dell'X fragile).

Un'altra caratteristica interessante di questa malattia è l'aggravamento della malattia in ogni generazione successiva (anticipazione genetica). Questo fenomeno è stato spiegato solo nell'ultimo decennio del 20 ° secolo, dopo la scoperta di un tipo speciale di mutazione: l'espansione del trinucleotide si ripete.

Se classifichiamo le malattie in base ai meccanismi patogenetici, un gruppo abbastanza ampio sarà costituito dalle malattie causate dall'espansione delle ripetizioni. L'essenza della mutazione è la seguente: nel genoma umano ci sono brevi sezioni (ad esempio triplette di nucleotidi), normalmente ripetute più volte, ma per qualche motivo il loro numero inizia ad aumentare bruscamente - decine e centinaia di volte - e il la lunghezza totale del frammento "balbuziente" (contenente ripetizioni) può aumentare fino a diverse migliaia di paia di basi (Fig. 2).

Figura 2. Immagina che il nostro genoma sia un testo molto lungo e che l'espansione in corso lo trasformi in una completa sciocchezza.

Successivamente si è scoperto che l'espansione è alla base della patogenesi non solo della sindrome dell'X fragile, ma anche della distrofia miotonica di tipo I e II, nonché di una serie di malattie neurodegenerative umane, ad esempio la sclerosi laterale amiotrofica e la malattia di Huntington. In totale, sono note circa 30 malattie caratterizzate da tale mutazione. Molte di queste patologie sono associate ad un aumento del numero di ripetizioni di (CHG)n, (CAG)n, (GAA)n e altri.

Cause e patogenesi della sindrome dell'X fragile

La sindrome dell'X fragile è forse la causa più comune di ritardo mentale ereditario dopo la sindrome di Down. Ci sono alcune manifestazioni cliniche della sindrome e non tutte e non sempre vengono osservate, ma le principali - un basso livello di intelligenza e sviluppo emotivo, insieme a una serie di anomalie fisiche - sono più spesso presenti. Queste caratteristiche sono già evidenti nella prima infanzia.

La causa della malattia risiede in un aumento del numero di ripetizioni di triplette CHG nella regione del promotore (piattaforma di lancio per l'inizio della sintesi dell'mRNA) del gene FMR1 (Fig. 3). Il prodotto di questo gene è la proteina FMRP (fragile X mental retardation protein), che interagisce con l'RNA e dirige le complesse cascate molecolari necessarie alla normale formazione dei neuroni e alla loro plasticità sinaptica. In una persona sana, il numero di ripetizioni varia da 5 a 54. Con un aumento del numero di ripetizioni a 55-200, appare un allele, chiamato premutante. Nella popolazione è abbastanza comune: uno su 200-250 persone. Sebbene il livello di mRNA del gene sia superiore al normale, il contenuto di FMRP rimane invariato o addirittura diminuisce leggermente. Perché ciò accada è ancora sconosciuto. Si può presumere che l'interferenza dell'RNA sia coinvolta in questo: il processo di soppressione dell'espressione genica (una fase del percorso dalla sequenza nucleotidica al prodotto finale, in questo caso FMRP) con l'aiuto di piccolo RNA.

Figura 3. La struttura del gene FMR1 e il suo schema di espressione. Regioni del gene 5'-UTR e 3'-UTR - 5'- e 3'-non tradotte.

Con un'espansione leggermente più pronunciata delle ripetizioni CHG nei pazienti, è possibile rilevare inclusioni intracellulari speciali costituite da mRNA FMR1 e proteine ​​​​leganti l'RNA. Questa è la prova che l'mRNA diventa tossico per la cellula. È interessante notare che l'mRNA "normale" non ha un effetto tossico anche a concentrazioni molto elevate. La maggior parte delle donne che sono portatrici della premutazione, a differenza degli uomini, non hanno manifestazioni esterne della patologia. Questo è il merito del secondo cromosoma X, che in una proporzione maggiore o minore di cellule compensa il difetto. Inoltre, ci sono dati sull'inattivazione preferenziale ("spegnimento") del cromosoma difettoso. Ma spesso queste donne sono caratterizzate da problemi emotivi, depressione e fobie.

L'inattivazione di uno dei cromosomi X è un processo vitale di compensazione della dose dei geni che impedisce il raddoppio dell'espressione di tutti i geni del cromosoma X nelle femmine rispetto ai maschi. Cioè, in ogni cellula di un individuo di qualsiasi sesso, nonostante l'insieme diploide di cromosomi, è attivo solo un cromosoma X, ereditato dal padre o dalla madre. Dettagli emozionanti dello "spegnimento" dei cromosomi sessuali negli esseri umani e nei vermi sono descritti negli articoli "Il misterioso viaggio dell'RNA Xist non codificante lungo il cromosoma X" e "Storie dalla vita del cromosoma X del nematode ermafrodito" . - Rosso

E, naturalmente, anche in assenza di segni esterni della malattia, l'allele premutante viene trasmesso alla prole. In questo caso, si verifica "l'amplificazione" della ripetizione - con ogni oogenesi, sempre di più, fino a diverse migliaia di "copie". E questo porta al fatto che l'allele premutante si trasforma in quello più mutante. In questo caso, stiamo parlando della sindrome dell'X fragile. La sua frequenza nella popolazione è di circa 1:3600–6000. È parecchio! Con un aumento così significativo del numero di ripetizioni di CHH, si verificano cambiamenti epigenetici: l'attaccamento di gruppi metilici alla citosina delle triplette di CHG nella regione del promotore FMR1 e la modifica delle proteine ​​​​correlate al DNA, gli istoni. Tutto ciò porta a un cambiamento locale nella densità di impaccamento del DNA: la formazione di cromatina condensata e inattiva, chiamata eterocromatina. L'espressione dei geni situati in tale zona viene soppressa. Pertanto, nel caso della sindrome di Martin-Bell, la produzione della proteina FMRP è nettamente ridotta. Inoltre, le modificazioni della cromatina causano una "fragilità" visiva del cromosoma nella regione Xq27, la stessa che gli scienziati hanno osservato a metà del 20° secolo. È vero, in tutta onestà va notato che in un paio del percento dei pazienti la sindrome non è causata dall'espansione delle ripetizioni CHG, ma da altre mutazioni nel gene FMR1.

Quindi, a quanto pare, i meccanismi patogenetici della sindrome del cromosoma X fragile e di altre malattie "espansive" sono comuni: tutte sono caratterizzate da un numero critico di triplette, in cui il gene funziona ancora normalmente. Le ragioni dell'espansione stessa non sono del tutto chiare. Ad oggi sono state proposte molte ipotesi e modelli che cercano di spiegarlo, ad esempio disturbi della replicazione, problemi con i sistemi di riparazione e così via. Tuttavia, nessuno di loro è stato ancora confermato sperimentalmente.

Perché è difficile diagnosticare l'espansione e come viene risolto questo problema?

Come già accennato, la sindrome dell'X fragile è tutt'altro che l'unica malattia che si manifesta come ritardo mentale. Ma le conoscenze accumulate hanno contribuito a sviluppare un metodo abbastanza dettagliato per diagnosticare questa particolare sindrome. È possibile rilevare anche una premutazione in persone con fenotipo normale (con un livello di QI normale e senza anomalie dello sviluppo). Questo è molto importante, poiché le donne portatrici hanno un alto rischio di avere figli con una sindrome pronunciata. È vero, questa tecnica non è priva di inconvenienti e, sfortunatamente, non è ampiamente utilizzata, quindi lo sviluppo di metodi diagnostici molecolari ha ancora un posto speciale.

Inizialmente, è stato effettuato uno studio del set cromosomico del paziente - cariotipizzazione - e se è stato rilevato un danno nella regione Xq27.3, è stata fatta una diagnosi. Questa è la prima cosa che i genetisti fanno oggi, almeno in Russia. Il problema con il cariotipo è che questo metodo non è abbastanza sensibile e quindi non molto affidabile. Pertanto, per la diagnosi vengono utilizzati metodi sempre più moderni. Esistono sistemi di test per la diagnostica del DNA basati su metodi chiave della biologia molecolare: PCR (Fig. 4), Southern blot, immunoprecipitazione, ecc. Consentono di stimare la quantità di proteina FMRP e il suo mRNA, determinare il numero di ripetizioni CHG e il livello di metilazione della citosina nel promotore del gene FMR1. Questo, a sua volta, aiuta a comprendere meglio la fisiopatologia della sindrome, perché i risultati dell'analisi possono essere correlati con il fenotipo dei pazienti e dei portatori della premutazione.

Figura 4. PCR - reazione a catena della polimerasi, uno dei metodi standard di biologia molecolare utilizzati nella diagnostica. Vengono mostrati i componenti principali senza i quali la reazione non andrà. Un modello di DNA è una molecola di DNA, una sezione della quale deve essere moltiplicata (amplificata) ripetutamente. I primer sono oligonucleotidi complementari alle estremità (su diversi filamenti) della regione del modello di DNA di interesse, come se la limitassero, e fungono da primer per l'enzima di copiatura del DNA (DNA polimerasi). dNTP - desossiribonucleoside trifosfati - materiale da costruzione per una nuova molecola di DNA. Buffer: una soluzione di sali che fornisce le condizioni necessarie (pH, forza ionica); contiene necessariamente un sale di magnesio, perché solo in presenza di ioni Mg2 + Funziona la DNA polimerasi. Se tutti i componenti vengono miscelati, inseriti in un dispositivo chiamato amplificatore (cycler) e viene avviato il programma desiderato di aumento-diminuzione ciclica della temperatura, sulla matrice delle singole molecole di DNA iniziali vengono sintetizzate migliaia di copie della regione di interesse , che alla fine sarà facile da studiare. Se, a causa di alcune mutazioni, le sequenze normalmente complementari ai primer cambiano, o la distanza tra loro aumenta radicalmente, semplicemente non ci sarà alcun prodotto della PCR.

La PCR è il metodo diagnostico principale. Consente di sviluppare una regione contenente (CHG)n. Dopo tale analisi, è possibile determinare l'esatta dimensione di questa regione, e quindi il numero di ripetizioni, e in questo modo rilevare alleli premutanti o mutanti nei pazienti. Ma va detto che questo non è facile da raggiungere. I ricercatori devono affrontare una serie di sfide nell'ampliare questi frammenti. Il DNA, che fungerà da modello per la sintesi di nuove molecole, ha una caratteristica come la composizione GC, che riflette quanto sia ricca la matrice in coppie guanina-citosina (una matrice ricca contiene circa il 60% di coppie GC). Se la percentuale di coppie di HC è elevata, la molecola sarà refrattaria e in alcune fasi della PCR sarà necessario effettuare una denaturazione più lunga. Il dominio (CHG)n è costituito al 100% da coppie HC ed è chiaro che questa è una matrice molto difficile.

Il tutto è ancora più complicato dal fatto che una tale sequenza senza molto sforzo forma varie strutture secondarie molto stabili termodinamicamente: tutti i tipi di forcine, G-quadruplex (quattro catene legate da guanine e sostenute da un catione monovalente, ad esempio K+) , i-motifs (strutture, costituite da quattro filamenti di DNA, ricche di citosina, stabili in ambiente acido). Lo studio di tali strutture è un compito molto bello e intrigante per biochimici e biofisici, ma è un serio ostacolo per stabilire la dimensione delle (CHG)n-regioni. E per di più, i primer (primer oligonucleotidici per la DNA polimerasi) possono formare dimeri con tali sequenze e la miscela di molecole si trasforma in una bobina termostabile e indecifrabile! È chiaro che semplicemente non puoi lavorare con una tale matrice. Ma! Per diversi anni, gli scienziati hanno attivamente escogitato sempre più nuove modifiche della PCR convenzionale che migliorano significativamente il risultato.

Poiché il modello ricco di HZ necessita di una denaturazione a temperatura più lunga e più elevata, si è tentato di riscaldare ulteriormente il modello prima della PCR. Tuttavia, come puoi immaginare, questo non ha risolto il problema. Alla fine degli anni '90, si è scoperto che la sintesi del DNA è interrotta in sezioni estese di ripetizioni CHG in presenza di K + e poco dopo si sono resi conto che la colpa era degli stessi quadruplex. Poiché KCl è incluso nel buffer PCR più comune, la decisione più ovvia è stata quella di escluderlo dal buffer; ha dato dei risultati, ma volevo di più. Pertanto, hanno iniziato a inventare attivamente buffer alternativi.

Ora la PCR viene spesso eseguita con l'aggiunta di Tris-HCl puro come tampone. Il Tris è un componente standard per la preparazione di soluzioni di acido nucleico: è economico e le sue proprietà tamponanti sono elevate a pH 7–9, valori fisiologici per gli organismi viventi. Il cloruro di magnesio deve essere aggiunto al Tris a concentrazioni che non inibiscano la DNA polimerasi e quindi non riducano la resa di uno specifico prodotto. Molto spesso, la miscela viene "migliorata" con varie sostanze che modificano le proprietà dell'intero complesso sistema PCR: DMSO, betaina, formammide - stabilizzano il DNA denaturato e aiutano ad abbassare il punto di fusione. Alcuni usano dNTP modificati, in particolare 7-deaza-dGTP, e ne notano l'efficacia (Fig. 5); questo nucleotide modificato impedisce la formazione di complessi duplex.

Figura 5. Mix PCR avanzato: la prima cosa necessaria per amplificare la regione (CHG)n. Disegno dell'autore dell'articolo.

Oltre ai componenti della miscela, esistono interessanti opzioni per i cicli di temperatura. La variante più semplice, spesso utilizzata per amplificare sequenze che non sono le più difficili da superare, è la PCR hot-start. La differenza tra questa modifica e la PCR standard è l'uso di anticorpi speciali che impediscono l'attivazione della polimerasi prima di raggiungere la temperatura desiderata, evitando la sintesi non specifica. Per lavorare con matrici estremamente ricche di HZ (>83%), è stata proposta una variante PCR chiamata Slowdown (Modifica Touchdown): velocità di riscaldamento e raffreddamento lente, diminuzione graduale della temperatura di annealing dopo un certo numero di cicli, aggiunta di 7 -deaza-dGTP - tutto ciò porta ad aumentare la resa del prodotto PCR target.

Tuttavia, non si può dire che il problema di ottenere le quantità di frammenti ricchi di HC (come la regione del promotore FMR1) necessarie per ulteriori analisi sia stato completamente risolto: articoli su questo argomento compaiono frequentemente, ma i risultati pubblicati sono contraddittori; le aziende commerciali competono per sviluppare kit "magici", ma possono costare così tanto che anche i laboratori stranieri di successo non possono permetterseli.

La determinazione della dimensione della regione (CHG)n è il primo e molto importante passo nello studio della sindrome dell'X fragile, che, tuttavia, deve ancora essere ottimizzata. Se impariamo a contare le ripetizioni in modo rapido ed efficiente, la diagnostica diventerà semplice e relativamente economica. Sarà possibile condurla su larga scala, il che significa distinguere la sindrome dell'X fragile da molte altre malattie accompagnate da ritardo mentale, che è estremamente importante nella scelta degli approcci terapeutici.

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