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Metodo Trap per la determinazione dell'attività antiossidante. Metodo chemiluminescente per la determinazione degli Antiossidanti (AO)

tesi

1.4 Metodi di ricerca per gli antiossidanti

le attività antiossidanti sono classificate: secondo le modalità di registrazione dell'AOA manifestata (volumetrica, fotometrica, chemiluminescente, fluorescente, elettrochimica); per tipo di fonte di ossidazione; per tipo di composto ossidato; secondo il metodo di misurazione del composto ossidato.

Tuttavia, i metodi più noti per determinare l'attività antiossidante sono:

1 TEAC (capacità antiossidante equivalente trolox): il metodo si basa sulla seguente reazione:

Metmioglobina + H 2 O 2 > Ferrylglobina + ABTS > ABTS * + AO.

Il Trolox Equivalence Method (TEAC) si basa sulla capacità degli antiossidanti di ridurre i cationi radicali 2,2-azinobis (ABTS) e quindi di inibire l'assorbimento nella parte a lunghezza d'onda lunga dello spettro (600 nm). Uno svantaggio significativo del metodo è la reazione a due stadi per ottenere un radicale. Ciò allunga il tempo di analisi e può aumentare la dispersione dei risultati, nonostante per l'analisi venga utilizzato un set standardizzato di reagenti.

2 FRAP (potere antiossidante ferrico riduttore): il metodo si basa sulla seguente reazione:

Fe(III)-Tripiridiltriazina+AO>Fe(II)-Tripiridiltriazina.

Capacità ferro-riducente/antiossidante (FRAP). Qui viene utilizzata la reazione di riduzione di Fe(III)-tripyridiltriazina a Fe(II)-tripyridiltriazina. Tuttavia, questo metodo non può determinare alcuni antiossidanti, come il glutatione. Questo metodo consente la determinazione diretta di antiossidanti a basso peso molecolare. A pH basso, la riduzione del complesso Fe(III) tripyridiltriazina al complesso Fe(II) è accompagnata dalla comparsa di un colore blu intenso. Le misurazioni si basano sulla capacità degli antiossidanti di sopprimere l'effetto ossidativo delle particelle di reazione generate nella miscela di reazione. Questo metodo è semplice, veloce ea basso costo di esecuzione.

3 ORAC (capacità di assorbimento dei radicali dell'ossigeno): il metodo si basa sulla seguente reazione:

Fe (II) + H 2 O 2 > Fe (III) + OH * + AO> OH * + Luminolo.

Determinazione della capacità di assorbire i radicali dell'ossigeno (ORAC). In questo metodo viene registrata la fluorescenza del substrato (ficoeritrina o fluoresceina), che si verifica a seguito della sua interazione con ROS. Se sono presenti antiossidanti nel campione di prova, si osserva una diminuzione della fluorescenza rispetto al campione di controllo. Questo metodo è stato originariamente sviluppato dal Dr. Guohua Cao presso il National Institute of Aging nel 1992. Nel 1996, il Dr. Cao si è unito al Dr. Ronald Pryer in un gruppo congiunto presso l'USDA Research Center for Aging, dove è stato utilizzato un metodo semiautomatico sviluppato.

4 TRAP (parametro antiossidante total radical trapping): il metodo si basa sulla seguente reazione:

AAPH+AO>AAPH* + PL (PE).

Questo metodo utilizza la capacità degli antiossidanti di interagire con il radicale perossilico 2,2-azobis(2-amidinopropano) dicloridrato (AAPH). Le modifiche TRAP consistono in metodi per registrare un segnale analitico. Molto spesso, nella fase finale dell'analisi, il radicale perossidico AAPH interagisce con un substrato luminescente (luminolo), fluorescente (diclorofluoresceina diacetato, DCFH-DA) o altro substrato otticamente attivo.

Il derivato idrosolubile della vitamina E Trolox (acido 6-idrossi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carbossilico) viene utilizzato come standard per i metodi TEAC, ORAC e TRAP.

Recentemente è aumentato l'interesse per l'uso di metodi elettrochimici per la valutazione dell'attività antiossidante. Questi metodi sono un'analisi altamente sensibile e veloce.

La valutazione dell'attività antiossidante di alcuni prodotti alimentari viene effettuata con il metodo potenziometrico, basato sull'uso della proprietà delle sostanze antiossidanti di partecipare alle reazioni redox dovute ai gruppi enolico (-OH) e sulfidrilico (-SH).

La determinazione delle proprietà antiossidanti delle soluzioni si basa sull'interazione chimica degli antiossidanti con il sistema mediatore, che porta a un cambiamento nel suo potenziale redox. La cella elettrochimica è un contenitore contenente una soluzione tampone K-Na-fosfato, un sistema mediatore Fe(III)/Fe(II) e un elettrodo complesso prima di misurare il potenziale redox. L'attività antiossidante è stimata in g-eq/l.

Il metodo amperometrico per determinare l'attività antiossidante si basa sulla misurazione della corrente elettrica che si verifica durante l'ossidazione della sostanza in esame sulla superficie dell'elettrodo di lavoro, che è sotto un certo potenziale. La sensibilità del metodo amperometrico è determinata sia dalla natura dell'elettrodo di lavoro che dal potenziale ad esso applicato. Il limite di rilevabilità del rivelatore amperometrico di polifenoli, flavonoidi a livello di nano-picogrammi, a concentrazioni così basse, c'è una minore probabilità di influenza reciproca di diversi antiossidanti nella loro presenza articolare, in particolare la manifestazione del fenomeno del sinergismo . Gli svantaggi del metodo includono la sua specificità: in queste condizioni, gli antiossidanti che si ossidano o si riducono nella regione dei potenziali di elettroriduzione dell'ossigeno non possono essere analizzati. I vantaggi del metodo includono la sua rapidità, prostata e sensibilità.

Metodo della coulometria galvanostatica che utilizza ossidanti elettrogenerati - il metodo è applicabile all'analisi degli antiossidanti liposolubili.

Sono stati sviluppati vari metodi per la determinazione dell'acido ascorbico:

un metodo amperometrico che utilizza un elettrodo di alluminio modificato con un film di esacianoferrato di nichel(II) mediante un metodo di immersione in soluzione semplice;

un metodo per la determinazione spettrofotometrica e visiva in fase solida dell'acido ascorbico utilizzando xerogel di acido silicico modificato con il reagente di Wawel e rame (II) come polvere indicatrice;

la determinazione chemiluminescente dell'acido ascorbico può essere effettuata mediante il metodo dell'iniezione di flusso secondo la reazione chemiluminescente della rodamina B con cerio (IV) in un mezzo di acido solforico.

determinazione dell'acido ascorbico nell'intervallo 10 -8 -10 -3 g/cm 3 mediante voltammetria anodica in mezzi acquosi e acquoso-organici.

Il più comune è il metodo FRAP, in quanto express, altamente sensibile. Negli ultimi decenni sono state sviluppate numerose varietà di metodi per determinare l'attività antiossidante con il metodo FRAP (tabella 1).

Tabella 1 Sviluppo del metodo FRAP e sua applicazione per determinare l'attività antiossidante di vari oggetti

	Oggetti di analisi	Appunti
	plasma del sangue	t=4min. Sono state studiate la stechiometria di reazione e l'additività.
	Tè, vino	Determinazione dell'AOA da polifenoli
		Vengono confrontati i valori AOA di diversi tipi di tè
Pulido, Bravo, Saura Calixto	Soluzioni modello	t=30 min. È stata rivelata l'influenza del solvente non acquoso
	Impianti
	sangue, tessuto	Metodo PIA. È stata verificata l'influenza di sostanze estranee.
Firuzi, Lacanna, Petrucci e.a.	Soluzioni modello	È stata studiata la sensibilità di determinazione di diversi AO in funzione della loro struttura e del potenziale redox.
Katalinico, Milos,	Vini vari
Temerdashev, Tsyupko e altri.	Miscele modello
Loginova, Konovalova	Medicinali. Preparativi	metodo di prova
Temerdashev, Tsyupko e altri.	Vini rossi secchi	Correlazione dell'AOA con altri indicatori di qualità del vino
La tabella 1 continua
	Miscele modello	La sensibilità della determinazione di diversi AO
Vershinin, Vlasova, Tsyupko	Miscele modello	È stata rilevata la non additività del segnale in assenza di un agente ossidante
Anisimovich, Deineka e altri.	Soluzioni modello	Vengono proposti parametri cinetici per la stima dell'AOA.

Note: etichettato convenzionalmente: analisi dell'iniezione di flusso PIA, TPTZ-tripyridiltriazina, DIP-2,2, -dipiridile, PHEN-o-fenantrolina, acido DPA-piridinedicarbossilico, FZ-ferrozina, acido AA-ascorbico, CT-catecolo, t - tempo di esposizione, min.

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Antiossidanti (AO)- sostanze che impediscono l'ossidazione. In un organismo vivente il principale fattore di ossidazione è la formazione di radicali liberi, pertanto l'azione degli antiossidanti nei sistemi biologici è considerata principalmente dal punto di vista della prevenzione dell'ossidazione delle sostanze organiche da parte dei radicali liberi.

Attualmente, esistono numerosi metodi diversi per la determinazione degli antiossidanti: fotometrici, chimici, elettrochimici, ecc. Tuttavia, molti di essi presentano notevoli inconvenienti che rendono difficile la comprensione e l'ulteriore utilizzo dei risultati ottenuti con questi metodi. Gli svantaggi più comuni includono quanto segue:

Vengono utilizzate condizioni artificiali o insolite per i sistemi biologici per misurare l'effetto antiossidante. Ad esempio, al posto delle reazioni biologiche dei radicali liberi, vengono utilizzate reazioni redox puramente chimiche o viene misurata la capacità di una sostanza di donare / accettare elettroni quando esposta a una corrente elettrica. I risultati delle misurazioni ottenute in tali condizioni non consentono di affermare che la sostanza in esame presenterà lo stesso effetto "antiossidante" nell'organismo.
La determinazione dell'azione antiossidante viene effettuata misurando la quantità di prodotti di ossidazione accumulati (marcatori di ossidazione). Pertanto, è effettivamente possibile determinare la quantità di antiossidante nel campione di prova, ma mancano informazioni molto importanti sull'attività dell'antiossidante. Ignorare l'attività di un antiossidante, a sua volta, può portare a errori significativi nella determinazione della sua quantità, ad esempio per gli antiossidanti "deboli" che agiscono lentamente ma per lungo tempo.

In generale, non esiste una standardizzazione nel campo della determinazione degli antiossidanti, che consenta di confrontare tra loro i risultati ottenuti con metodi diversi.

Metodo chemiluminescente è il metodo più informativo per studiare gli antiossidanti e presenta numerosi vantaggi significativi:

Determinazione diretta dell'attività antiossidante- si registra l'azione diretta degli antiossidanti sui radicali liberi. Il metodo chemiluminescente utilizza un sistema di generazione di radicali liberi chimici che produce un bagliore chemiluminescente di controllo. Quindi un antiossidante viene aggiunto a tale sistema, che neutralizza i radicali liberi, il che porta alla soppressione della chemiluminescenza di controllo.
Un vantaggio significativo di questo approccio è la possibilità di utilizzare vari sistemi chimici per la generazione di radicali liberi, il che consente di determinare ulteriormente la specificità degli antiossidanti e la localizzazione della loro azione.
Misurazione delle caratteristiche quantitative e qualitative degli antiossidanti- il metodo chemiluminescente permette di caratterizzare qualsiasi composto ad effetto antiossidante mediante due indicatori indipendenti:
- Capacità antiossidante (AOE)- la quantità totale di radicali liberi in grado di neutralizzare il composto contenuto nel campione di un certo volume.
- Attività antiossidante (AOA)- il tasso di neutralizzazione dei radicali liberi, ad es. il numero di radicali neutralizzati per unità di tempo.

Metodo chemiluminescente fornisce un'importante comprensione del fatto che l'azione degli antiossidanti deve essere valutata da due indicatori: quantitativo (AOE) e qualitativo (AOA).
La figura seguente mostra questa posizione:

Influenza di diversi antiossidanti sulla chemiluminescenza
(i numeri accanto ai grafici indicano la concentrazione dell'antiossidante):
a sinistra - un antiossidante "forte", a destra - un antiossidante "debole".

Gli antiossidanti differiscono significativamente nella loro attività. Ci sono antiossidanti "forti", ad es. antiossidanti ad alta attività, che inibiscono i radicali liberi ad alta velocità e inibiscono completamente la chemiluminescenza. Tali antiossidanti hanno il massimo effetto già a basse concentrazioni e vengono rapidamente consumati. D'altra parte, ci sono antiossidanti "deboli", ad es. antiossidanti a bassa attività, che inibiscono i radicali liberi a bassa velocità e sopprimono solo parzialmente la chemiluminescenza. Tali antiossidanti hanno un effetto significativo solo ad alte concentrazioni, ma vengono consumati lentamente e agiscono a lungo.

Il metodo chemiluminescente può essere utilizzato per determinare i parametri antiossidanti:

fluidi biologici (plasma, saliva, urina);
preparati farmacologici e additivi biologicamente attivi;
bevande e additivi alimentari;
cosmetici e prodotti per la cura;
e così via.

Per implementare il metodo chemiluminescente per la determinazione degli antiossidanti, si consiglia di utilizzare le seguenti apparecchiature:

Chemiluminometer Lum-100 - fornisce il controllo della temperatura e la registrazione della chemiluminescenza di 1 campione.
Chemiluminometer Lum-1200: fornisce il controllo della temperatura e la registrazione simultanea della chemiluminescenza fino a 12 campioni.

1 Milentiev V.N. 2Sannikov D.P. 3Kazmin VM 2

1 Oryol Istituto statale di economia e commercio

2 Istituzione di bilancio dello Stato federale "Centro per la chimica e la radiologia agricola "Orlovsky"

3 Istituto statale per l'istruzione di bilancio professionale superiore "Università statale - Complesso educativo, scientifico e industriale"

È stata studiata la possibilità di utilizzare la chemiluminescenza per valutare l'attività antiossidante delle sostanze alimentari. Il metodo proposto si basa sulla chemiluminescenza del luminolo in un mezzo alcalino, la cui intensità dipende dalla quantità di perossidi nel campione chemiluminescente. La chemiluminescenza è stata registrata utilizzando una configurazione sviluppata contenente una pompa dosatrice, una camera a tenuta di luce, un tubo fotomoltiplicatore sottovuoto in vetro e un sistema informatico. Per migliorare la chemiluminescenza, al luminolo è stata aggiunta una soluzione di ferricianuro di potassio. Le variazioni dell'intensità della chemiluminescenza sono state registrate al momento dell'introduzione del campione analizzato nella soluzione di luminolo. Come campione analizzato è stato utilizzato l'estratto di tarassaco ottenuto mediante distillazione secca a bassa temperatura. Contiene composti fenolici noti per la loro elevata attività antiossidante. È stato stabilito che il metodo della chemiluminescenza può essere utilizzato per determinare le proprietà antiossidanti di vari composti alimentari.

chemiluminescenza

attività antiossidante

perossidi

nutrienti

1. Vasiliev RF Bagliore chimico // Chimica e chimica, 21.01.10. – URL: http://chemistry-chemists.com. (data di accesso: 22.08.13).

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3. Kondrashova E.A. La chemiluminescenza come metodo più sensibile di immunodosaggio enzimatico e sua applicazione Diagnostica clinica di laboratorio. - 1999. - N. 9. - P. 32.

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Oggi, la chemiluminescenza è una vasta area della scienza situata all'interfaccia tra chimica, fisica e biologia. Con la chemiluminescenza si ha una conversione diretta dell'energia chimica nell'energia delle oscillazioni elettromagnetiche, ad es. nel mondo. Utilizzando la chemiluminescenza, si può apprendere come procede la reazione, qual è il suo meccanismo, necessario per lo svolgimento efficiente e razionale dei processi tecnologici. Se il processo tecnologico per ottenere qualsiasi prodotto chimico è accompagnato dalla chemiluminescenza, la sua intensità può servire come misura della velocità del processo: più veloce è la reazione, più luminoso è il bagliore. Durante la reazione di chemiluminescenza si ottengono prodotti ricchi di energia, che poi emettono energia emettendo luce, cioè l'energia chimica viene convertita in energia di radiazione elettromagnetica.

Lo scopo dello studio era di esplorare la possibilità di utilizzare la chemiluminescenza per valutare l'attività antiossidante delle sostanze alimentari.

Risultati della ricerca e discussione

Il problema della valutazione dell'attività antiossidante delle sostanze alimentari è molto rilevante. L'uso del termine "attività antiossidante" per mostrare l'utilità di un particolare prodotto è spesso fatto senza alcun argomento chimico e biochimico. Di norma, l'attività antiossidante di qualsiasi sostanza si riferisce all'efficacia di ridurre il valore del perossido. Anche il concetto stesso di valore del perossido non rivela completamente la sua essenza chimica, poiché non corrisponde pienamente alla cinetica e alla termodinamica delle fasi del metabolismo di un particolare prodotto alimentare. Inoltre, questo valore viene utilizzato per caratterizzare i lipidi sotto forma di grassi. Tuttavia, i processi di ossidazione e formazione di perossidi nel corpo si verificano non solo con l'uso di grassi, ma anche con altri prodotti. In altre parole, si può dire che il contenuto di perossido in un determinato prodotto sia “pesato” su una specie di bilancia, dove il “peso di riferimento” è un'unità di concentrazione in ambiente acido di uno ione ioduro ossidato dai perossidi, poiché un risultato del quale si forma iodio molecolare:

I- - e → I; (uno)

I + I → I20. (2)

Quando lo iodio molecolare viene titolato con una soluzione contenente tiosolfato di sodio, viene stabilita la sua concentrazione e, di conseguenza, viene determinata la quantità di agenti ossidanti degli ioni ioduro, ad es. composti di perossido, che in realtà è chiamato numero di perossido. La determinazione del valore di perossido utilizzando questo tipo di "pesatura" si basa sulla reazione mostrata in fig. uno.

Riso. 1. Determinazione del valore di perossido mediante tiosolfato di sodio

Pertanto, la concentrazione di perossidi è determinata dall'equazione

С(I2) = ϒ(C[-O-O-]), (3)

dove ϒ è il coefficiente di correlazione tra la concentrazione di iodio molecolare e la concentrazione di perossidi.

Il metodo proposto per la determinazione dei perossidi nei prodotti si basa sulla chemiluminescenza del luminolo (C[lm]) in un mezzo alcalino, la cui intensità (Ichl) dipende dalla concentrazione dei perossidi (C[-OO-]), in un campione chemiluminescente:

DIU. = Ϧchl ω, (4)

dove Ϧchl è la resa quantistica della chemiluminescenza; ω - velocità di reazione che coinvolge i perossidi:

khlC[-O-O-] C[lm] = ω, (5)

dove kchl è la costante di velocità di reazione o a:

C[lm] kchl Ϧchl = K, (6)

IХЛ = K C[-O-O-]. (7).

La quantità di perossidi (-O-O-) è determinata dalla somma di luce (S):

Il valore di S dipende dal grado di completezza del consumo di perossido nella reazione chemiluminescente.

Per determinare la costante K, viene costruita una curva di calibrazione per la dipendenza della somma di luce S dalla concentrazione di perossido, che è determinata dalla titolazione:

S = f(C[-O-O-]). (9)

Il perossido di idrogeno H2O2 è usato come perossidi.

Quindi vengono confrontati i dati ottenuti dall'equazione (3) e (9). Sulla base del confronto di ϒ e K, si trae una conclusione sull'accordo dei meccanismi di reazione alla base della determinazione dei perossidi con questi metodi. Si è riscontrato che in questo intervallo di concentrazioni di perossido ϒ e K sono effettivamente d'accordo tra loro e quindi possono essere utilizzate per determinare il valore di perossido.

La chemiluminescenza è stata osservata in un mezzo alcalino contenente luminolo (5-ammino-1,2,3,4-tetraidro-1,4-ftalazinedione, 3-amminoftalico idrazide, H2L). È stato registrato utilizzando una configurazione chemiluminescente, incluso un fotomoltiplicatore sottovuoto in vetro. Il fotomoltiplicatore è alimentato da un raddrizzatore di alta tensione (7) accoppiato ad un blocco (9) che amplifica il segnale del fotomoltiplicatore, che viene registrato sul display del monitor del computer (5).

Riso. 2. Registrazione della chemiluminescenza del prodotto analizzato: 1 - pompa dosatrice; 2 - camera a prova di luce; 3 - specchio; 4 - cuvetta; 5 - sistema informatico; 6 - fotomoltiplicatore; 7 - raddrizzatore ad alta tensione; 8 - un dispositivo che consente di determinare la regione spettrale della radiazione chemiluminescente; 9 - blocco amplificando il segnale del fotomoltiplicatore

È necessaria una pompa dosatrice (1) per introdurre il campione analizzato in una cuvetta (4) contenente una soluzione chemiluminescente di luminolo. Questo erogatore funge da agitatore per il campione iniettato con una soluzione chemiluminescente. Per aumentare la velocità di reazione e l'intensità della chemiluminescenza, una soluzione di ferricianuro di potassio è stata aggiunta al luminolo. La miscelazione viene effettuata mediante bolle d'aria ottenute pompando aria attraverso il liquido di soluzione con una pompa. Lo specchio (3) posto nella camera opaca (2) serve per una migliore raccolta della luce della radiazione chemiluminescente incidente sul fotocatodo del fotomoltiplicatore (6) montato nella camera opaca. Il dosatore consente di inserire i componenti desiderati del liquido nella cuvetta senza aprire la camera a tenuta di luce (2) durante gli esperimenti. In questo caso, questi liquidi entrano nella cuvetta (4) attraverso tubi di vetro o plastica. Il sistema informatico consente di registrare la dipendenza dell'intensità della luminescenza I dal tempo t, ovvero la cinetica della chemiluminescenza:

Il sistema informatico riflette le costanti di salita e di discesa nella funzione I = f(t), che sono coniugate con le costanti di velocità delle reazioni che provocano la chemiluminescenza, cioè con la loro cinetica. Nella camera chemiluminescente è incluso un dispositivo (8), che consente di determinare la regione spettrale della radiazione chemiluminescente, ovvero la dipendenza:

I = f1(λ). (undici)

Questo blocco è una cassetta a forma di disco, in cui sono montati filtri perimetrali. Il cambio dei filtri luminosi viene effettuato ruotando la cassetta del disco attorno all'asse orizzontale che collega i centri del piano dei filtri luminosi e il piano del fotocatodo del fotomoltiplicatore.

Il processo di misurazione viene eseguito come segue:

1. Viene impostata la risposta del fotomoltiplicatore alle variazioni della sua tensione di alimentazione e alle variazioni dell'intensità della sorgente luminosa di riferimento che cade sul suo catodo.

2. La cuvetta viene riempita con una soluzione di luminol in un mezzo alcalino.

3. Il dispenser viene riempito con il campione analizzato.

4. Viene registrata la dipendenza dell'intensità della chemiluminescenza dal tempo t. La chemiluminescenza viene monitorata fino all'istante t1, in cui la variazione di I1 dall'istante t è minima: I1 = f1(t).

5. Una parte della soluzione analizzata viene alimentata mediante un dosatore.

6. Si osserva la chemiluminescenza del campione analizzato, la cui cinetica è I = f(t).

Sulla fig. La figura 3 mostra un grafico della dipendenza delle funzioni (I1 = f1(t)), coniugate con un grafico (I = f(t)), dopo l'introduzione della soluzione analizzata.

Come si può vedere dalla figura. 3, l'intensità della chemiluminescenza del luminol cambia: un forte aumento è seguito da una forte diminuzione della luminescenza dopo l'aggiunta del campione analizzato.

Poiché l'aumento della chemiluminescenza durante l'ossidazione del luminolo è associato alla formazione di perossidi, la diminuzione dell'intensità della chemiluminescenza dopo l'introduzione del campione analizzato indica una diminuzione del loro numero. Si può quindi parlare della presenza di attività antiossidante nei composti che compongono il campione analizzato.

Si precisa che come campione analizzato è stato utilizzato l'estratto di tarassaco ottenuto per distillazione secca a bassa temperatura, che contiene composti fenolici noti per la loro elevata attività antiossidante.

Riso. Fig. 3. Grafico delle dipendenze delle funzioni (I1 = f1(t)), coniugato con il grafico (I = f(t)), dopo l'introduzione della soluzione analizzata

Inoltre, durante l'esperimento è stato riscontrato che mediante la chemiluminescenza è possibile determinare la quantità di perossidi nei sistemi superdiluiti, importante per valutare l'inizio dell'ossidazione dei prodotti, ad esempio, durante la loro conservazione.

Pertanto, gli studi condotti hanno dimostrato che il metodo per la determinazione dei perossidi nei prodotti, basato sulla chemiluminescenza del luminolo in un mezzo alcalino, consente di valutare l'attività antiossidante delle sostanze alimentari e può essere utilizzato per stabilire le proprietà antiossidanti di vari alimenti composti.

Revisori:

Litvinova E.V., dottore in scienze tecniche, professore del dipartimento di tecnologia, organizzazione e igiene alimentare, OrelGIET, Orel;

Kovaleva O.A., dottore in scienze biologiche, direttore degli INIT, FSBEI HPE "Oryol State Agrarian University", Orel.

Il lavoro è stato ricevuto dalla redazione l'8 novembre 2013.

Collegamento bibliografico

Panichkin AV, Bolshakova L.S., Milentiev V.N., Sannikov D.P., Kazmin V.M. UTILIZZO DELLA CHEMILUMINESCENZA PER LA VALUTAZIONE DELLE PROPRIETÀ ANTIOSSIDANTI DEI NUTRIENTI // Ricerca fondamentale. - 2013. - N. 10-11. – S. 2436-2439;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32810 (data di accesso: 17/12/2019). Portiamo alla vostra attenzione le riviste pubblicate dalla casa editrice "Accademia di Storia Naturale" 1 Bolshakova L.S. unoMilentiev V.N. 2Sannikov D.P. 3Kazmin VM 2

1 Oryol Istituto statale di economia e commercio

2 Istituzione di bilancio dello Stato federale "Centro per la chimica e la radiologia agricola "Orlovsky"

3 Istituto statale per l'istruzione di bilancio professionale superiore "Università statale - Complesso educativo, scientifico e industriale"

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Panichkin AV, Bolshakova L.S., Milentiev V.N., Sannikov D.P., Kazmin V.M. UTILIZZO DELLA CHEMILUMINESCENZA PER LA VALUTAZIONE DELLE PROPRIETÀ ANTIOSSIDANTI DEI NUTRIENTI // Alimentazione razionale, additivi alimentari e biostimolanti. - 2014. - N. 6. - P. 36-37;
URL: http://journal-nutrition.ru/ru/article/view?id=283 (data di accesso: 17/12/2019). Portiamo alla vostra attenzione le riviste pubblicate dalla casa editrice "Accademia di Storia Naturale"

L'invenzione riguarda l'industria alimentare e può essere utilizzata per determinare l'attività antiossidante totale. Il metodo si effettua come segue: l'analita interagisce con il reagente 0,006 M Fe(III) - 0,01 M o-fenantrolina. L'acido ascorbico (AA) interagisce con lo stesso reagente, che viene aggiunto in un rapporto di 1:100. Quindi incubato per almeno 90 minuti e fotometrico a 510±20 nm. Successivamente, viene stabilita la dipendenza del valore del segnale analitico dalla quantità della sostanza e viene calcolato il valore dell'AOA totale. Il metodo presentato consente una determinazione meno dispendiosa in termini di tempo e più affidabile dell'attività antiossidante totale dei materiali vegetali e dei prodotti alimentari basati su di essa. 2 p.p. f-ly, 1 ill., 5 tab.

L'invenzione riguarda la chimica analitica e può essere utilizzata per determinare l'attività antiossidante totale (AOA) di materiali vegetali e prodotti alimentari a base di essa.

Metodo coulometrico noto per la determinazione dell'AOA totale del tè, basato sull'interazione di estratti acquosi del prodotto con composti di bromo generati elettricamente (IF Abdulin, E.N. Turova, G.K. Chemistry, 2001, vol. 56, n. 6, pp. 627- 629). La scelta dei composti di bromo elettrogenerati come titolante è dovuta alla loro capacità di entrare in varie reazioni: sostituzione radicale, redox, elettrofila e addizione per legami multipli. Ciò consente di coprire un'ampia gamma di composti del tè biologicamente attivi con proprietà antiossidanti. Gli svantaggi del metodo sono la possibilità della reazione di bromurazione con sostanze non antiossidanti, e l'espressione del valore risultante dell'AOA totale in unità della quantità di elettricità (kC/100 g), che rende difficile la valutazione i risultati.

Un noto metodo voltammetrico per determinare l'attività antiossidante totale mediante la variazione relativa della corrente di elettroriduzione dell'ossigeno nell'intervallo di potenziale da 0,0 a -0,6 V (rel. sat. c.s.e.) su un elettrodo a film di mercurio (Brev. IPC 7 G 01 N 33/01 Metodo voltammetrico per determinare l'attività totale degli antiossidanti / EI Korotkova, Yu. Lo svantaggio di questo metodo è il verificarsi di reazioni elettrochimiche laterali, che riducono l'efficienza della determinazione degli antiossidanti, il che porta a una diminuzione dell'affidabilità dei risultati.

Un metodo noto per controllare l'AOA totale di agenti antiossidanti profilattici e terapeutici per la perossidazione lipidica ad aldeide malonica con rilevamento spettrofotometrico o chemiluminescente (Brevetto 2182706, Russia, IPC 7 G 01 N 33/15, 33/52. fondi / Pavlyuchenko II, Basov AA, Fedosov SR - n. 2001101389/14; domanda 15/01/2001; publ. 20/05/2002). Allo stesso tempo, l'attività antiossidante è inversamente proporzionale al livello dei prodotti di perossidazione lipidica. Lo svantaggio di questo metodo può essere considerato una gamma limitata di oggetti analizzati, poiché in queste condizioni vengono determinati gli antiossidanti di un solo gruppo, i lipidi.

Metodo noto per la determinazione dell'AOA totale di un estratto vegetale, che consiste nell'incubare l'estratto con linetolo e solfato di ferro (II), avviare la reazione di ossidazione con irraggiamento UV e successiva interazione con acido tiobarbiturico in presenza di tritone X-100 ( Domanda 97111917/13, Russia, IPC 6 G 01 N 33/00 Metodo per la determinazione dell'attività antiossidante totale / Rogozhin VV - Ricorso 08.07.1997; publ. 10.06.1999). Quando si esegue la spettrofotometria, viene utilizzata una miscela di etanolo e cloroformio in un rapporto di 7:3. Il valore AOA di un materiale biologico è determinato dal rapporto tra l'accumulo del prodotto di reazione - malondialdeide in un campione contenente un estratto e un campione con un proossidante. Lo svantaggio di questo metodo risiede nella possibilità di reazioni collaterali durante l'irradiazione UV, che riduce l'affidabilità dei risultati dell'analisi.

I metodi elencati per determinare l'AOA totale presentano una serie di svantaggi: alta intensità di lavoro, bassa affidabilità, il valore misurato dell'AOA totale non è correlato e non è confrontabile con nessuna sostanza convenzionale.

L'analogo più vicino all'invenzione rivendicata è un metodo per determinare l'AOA totale di piante medicinali misurando la chemiluminescenza che si verifica quando si reagisce con il luminolo in presenza di un agente ossidante perossido di idrogeno (M.Kh. scagliola per chemiluminescenza // Journal of Chimica analitica, 2004, V.59, n. 1, P.84-86). Per una valutazione quantitativa dell'AOA totale, sono state confrontate la capacità riducente dell'estratto di materie prime medicinali e l'attività di un potente antiossidante - acido ascorbico nella quantità di 25-110 μg. Rispetto ai metodi di cui sopra, nel prototipo, il perossido di idrogeno viene utilizzato come agente ossidante, interagendo con un'ampia gamma di antiossidanti, e il valore misurato dell'AOA totale dell'oggetto viene determinato ed espresso rispetto all'acido ascorbico, che è un antiossidante comune, che consente di ottenere risultati affidabili pur mantenendo altri svantaggi. Gli svantaggi includono anche la complessità dell'attrezzatura utilizzata nel metodo.

L'obiettivo tecnico dell'invenzione rivendicata è lo sviluppo di un metodo meno dispendioso in termini di tempo e affidabile per determinare l'attività antiossidante totale di materiali vegetali e prodotti alimentari a base di esso.

Per risolvere il problema tecnico, si propone di far interagire l'analita con il reagente 0,006 M Fe (III) - 0,01 M o-fenantrolina e acido ascorbico (AA) con lo stesso reagente, che viene aggiunto in un rapporto di 1:100 , incubato per almeno 90 minuti, fotometrico a 510±20 nm, seguito da stabilire la dipendenza del segnale analitico dalla quantità di sostanza e calcolare l'AOA totale. In particolare, il calcolo può essere effettuato secondo la formula (I), derivata dall'equazione di corrispondenza quantitativa tra l'oggetto in studio e l'acido ascorbico:

dove a, b sono i coefficienti nell'equazione di regressione per la dipendenza del segnale analitico dalla quantità di AA;

a", c" - coefficienti nell'equazione di regressione per la dipendenza del segnale analitico dalla quantità dell'oggetto in studio;

x sole. - massa dell'agente riducente studiato (campione), mg.

L'uso del reagente proposto in queste condizioni ha permesso di ampliare l'intervallo lineare e di ridurre il limite inferiore delle quantità determinate di acido ascorbico. L'insieme delle caratteristiche essenziali proposto consente di determinare l'AOA totale di un'ampia gamma di materiali vegetali e prodotti alimentari a base di esso.

Le equazioni di corrispondenza quantitativa collegano la dipendenza del segnale analitico dalla quantità di acido ascorbico e la dipendenza del segnale analitico dalla quantità dell'oggetto in studio, a condizione che l'attività antiossidante sia uguale.

Dopo aver elaborato i risultati delle misurazioni fotometriche dell'ampiezza del segnale analitico con il metodo dei minimi quadrati (K. Derffel Statistics in analytics chemistry. - M .: "Mir", 1994. S. 164-169; AK Charykov Elaborazione matematica del risultati dell'analisi chimica - L.: Chemistry, 1984. S.137-144) queste dipendenze sono state descritte da una funzione di regressione lineare: y=ax+b, dove a è il coefficiente di regressione, b è un membro libero. Il coefficiente a nell'equazione di regressione è uguale alla tangente della pendenza della retta all'asse x; coefficiente b - distanza lungo l'asse y dall'origine (0,0) al primo punto (x 1 , y 1).

I coefficienti aeb si calcolano con le formule:

L'equazione di regressione per la dipendenza di AS dalla quantità di acido ascorbico in un dato momento ha la forma:

y AK \u003d a x AK (mg) + b,

equazione di regressione per la dipendenza di AS dalla quantità dell'oggetto in studio (agente riducente):

y VOST \u003d a "x VOST (mg) + b",

dove per AK, per VOST è la densità ottica della soluzione fotometrica;

x AK (mg), x VOST (mg) - concentrazione di acido ascorbico (agente riducente) in soluzione;

quindi, eguagliando i valori delle funzioni, otteniamo la formula (I) per calcolare l'attività antiossidante dell'oggetto in studio in unità della quantità (mg) di acido ascorbico.

Il disegno mostra la dipendenza del segnale analitico dalla quantità di agente riducente.

La densità ottica delle soluzioni analizzate è stata misurata su un colorimetro fotoelettrico KFK-2MP.

È noto (F. Umland, A. Yasin, D. Tirik, G. Vunsch Complessi composti in chimica analitica - M.: Mir, 1975. - 531 p.) che l'o-fenantrolina forma un chelato solubile in acqua con il ferro ( II) colore rosso-arancio, caratterizzato da un massimo di assorbimento a λ=512 nm. Pertanto, nel metodo proposto, la fotometria viene eseguita a λ=510±20 nm.

L'ottimizzazione della composizione del reagente e della sua quantità introdotta nella reazione è stata effettuata sulla base dei risultati della pianificazione multifattoriale dell'esperimento utilizzando il metodo del quadrato latino, che consisteva nel modificare tutti i fattori studiati in ogni esperimento, e ciascuno livello di ogni fattore solo una volta incontra diversi livelli di altri fattori. Ciò consente di identificare e valutare separatamente l'effetto causato da ciascun fattore oggetto di studio.

Sono stati utilizzati i seguenti fattori: le quantità di Fe(III), o-fenantrolina e il volume del reagente introdotto nella reazione. La combinazione di fattori dovrebbe fornire un'ampia gamma di linearità del segnale analitico (AS) con sufficiente sensibilità, da un lato, e stabilità del reagente nel tempo, dall'altro. Ciò ha consentito di individuare per ciascun fattore i seguenti livelli:

la quantità di Fe(III): 0,003 M (A 1); 0,006 M (LA 2); 0,009 M (LA 3);

quantità di o-fenantrolina: 0,01 M (B 1); 0,02 M (B2); 0,03 M (B 3);

volume del reagente: 0,5 ml (C 1); 1,0 ml (C2); 2,0 ml (C 3) (Tabella 1).

Per selezionare la combinazione ottimale dei livelli dei fattori, sono state ottenute le dipendenze di calibrazione di AS sulla quantità di acido ascorbico nell'intervallo da 10 a 150 μg (necessario per confermare la linearità della funzione), l'equazione di regressione della dipendenza ottenuta è stata calcolato e quindi il valore di AS a una determinata quantità (120 μg) di acido ascorbico. Pertanto, per ciascuna composizione del reagente (fattori A, B), è stato selezionato il volume (fattore C), al quale il valore AC è massimo. Ciò ha consentito di ridurre a nove il numero delle combinazioni considerate (Tabella 2).

Confrontando gli AS totali per ciascun livello, sono stati individuati gli importi con il valore massimo: ΣA 2 (0,991); ΣB 1 (1.066); ΣC 2 (1.361). Ciò ha permesso di concludere che la composizione del reagente è ottimale: 0,006 M Fe (III) - 0,01 M o-fenantrolina con il suo volume introdotto nella reazione, 1,0 ml per 100 ml di soluzione.

Alla concentrazione ottimale del reagente, abbiamo studiato la variazione della dipendenza dell'AS dalla concentrazione di acido ascorbico e di alcuni agenti riducenti comuni negli oggetti naturali (tannino, rutina, quercetina) a diversi tempi di incubazione della miscela di reazione (30, 60 , 90, 120 minuti). Si è riscontrato che per tutti gli agenti riducenti studiati, la dipendenza dell'AS dal loro contenuto è lineare nell'intervallo di 10-150 μg (vedi disegno) e il valore dell'AS dipende dal tempo di incubazione (tabella 3).

Dal disegno si può vedere che la variazione di AC sotto l'azione della rutina è insignificante, il tannino si avvicina e la quercetina supera la stessa dipendenza dall'acido ascorbico. Considerando la variazione di AC dal momento dell'incubazione per tutti gli agenti riducenti studiati (tabella 3), si è riscontrato che la stabilizzazione del segnale analitico nel tempo si osserva a partire da 90 minuti.

Tabella 3 Modifica nel tempo dell'AS degli agenti riducenti
Sostanza di prova	m sostanze, mg/cm 3	Segnale analitico
Sostanza di prova	m sostanze, mg/cm 3	Tempo di incubazione della miscela di reazione, min
30	60	90	120
Vitamina C	10	0,038	0,042	0,044	0,044
100	0,340	0,352	0,360	0,363
Tannino	10	0,029	0,037	0,042	0,043
100	0,280	0,295	0,303	0,308
Rutino	10	0,013	0,016	0,019	0,019
100	0,150	0,166	0,172	0,175
Quercetina	10	0,031	0,044	0,051	0,053
100	0,420	0,431	0,438	0,442

Per dimostrare la natura sommatoria del valore di AOA determinato, è stato studiato l'effetto del reagente Fe (III) - o-fenantrolina su soluzioni modello, che includevano agenti riducenti: tannino, rutina, quercetina e acido ascorbico in vari rapporti. La tabella 4 presenta i risultati dell'analisi delle miscele modello.

Tabella 4 Risultati dell'analisi delle miscele modello (P=0,95; n=3)
Il numero di componenti nella miscela	AOA totale, calcolato, mcgAA	AOA totale, trovato, mcgAA
introdotto	AOA totale, calcolato, mcgAA	AOA totale, trovato, mcgAA	in termini di AK
AK	Tannino	Rutino	Quercetina	AK	Tannino	Rutino	Quercetina
-	20	20	20	-	16,77	9,56	32,73	59,06	57,08
-	10	10	10	-	8,35	4,77	16,41	29,53	26,95
-	50	10	10	-	42,02	4,77	16,41	63,20	55,04
-	10	50	10	-	8,35	23,93	16,41	48,69	50,06
-	10	10	50	-	8,35	4,77	81,70	94,82	91,61
-	30	10	10	-	25,19	4,77	16,41	46,37	39,24
-	10	30	30	-	8,35	14,35	49,06	71,76	73,47
20	20	20	20	20	16,77	9,56	32,73	79,06	96,29
50	10	10	10	50	8,35	4,77	16,41	87,95	93,07
10	50	10	10	10	42,02	4,77	16,41	73,20	78,15
10	10	50	10	10	8,35	23,93	16,41	58,69	78,74
10	10	10	50	10	8,35	4,77	81,70	104,82	121,45
30	30	10	10	30	25,19	4,77	16,41	76,37	84,59
10	10	30	30	10	8,35	14,35	49,06	81,76	103,31

Il calcolo del valore teorico dell'AOA totale è stato effettuato secondo le equazioni di corrispondenza quantitativa caratterizzanti la capacità antiossidante dell'agente riducente studiato rispetto all'acido ascorbico, in condizioni di pari attività antiossidante: .

Il valore dell'AOA sperimentale (trovato) è stato calcolato utilizzando l'equazione di regressione media per la dipendenza di AS dalla quantità di acido ascorbico. Dai risultati presentati in Tabella 4, si può vedere che i valori di AOA ottenuti sperimentalmente concordano in modo soddisfacente con quelli calcolati teoricamente.

Pertanto, il valore determinato di AOA è un indicatore totale e la determinazione del suo valore utilizzando le equazioni di corrispondenza quantitativa è corretta.

Il metodo proposto è stato testato su campioni reali. Per determinare l'AOA totale di un campione reale o del suo estratto, sono state ottenute le dipendenze di calibrazione di AS dalla quantità di analita e acido ascorbico ad un tempo di incubazione della miscela di reazione di almeno 90 minuti. Il calcolo dell'AOA totale è stato effettuato secondo la formula (I) ed è stato espresso in mg di acido ascorbico per grammo dell'oggetto in esame (mgAA/g).

Per confermare la correttezza del metodo proposto, questi campioni sono stati testati secondo metodi noti, valutando il contenuto di acido ascorbico (GOST 24556-89 Prodotti trasformati di frutta e verdura. Metodi per determinare la vitamina C) e gli agenti riducenti prevalenti: nel tè - tannino (GOST 19885-74 Tea. Metodi per determinare il contenuto di tannino e caffeina), nei cinorrodi - la quantità di acidi organici (GOST 1994-93 Rosa canina. Specifiche) (tabella 5).

Tipo