Quantificazione degli amminoacidi. Analisi qualitativa comparativa degli amminoacidi

Metodi per la determinazione degli aminoacidi

Gli amminoacidi sono sostanze biologicamente attive, svolgono un ruolo importante nella vita del corpo umano, sono ampiamente usati come medicinali. Alcuni di loro sono indispensabili ed entrano nel corpo con il cibo. Attualmente, esistono numerosi metodi per la determinazione quantitativa degli amminoacidi nei materiali vegetali medicinali, nei farmaci e nei fluidi biologici e nei prodotti alimentari.

Dall'intera varietà di metodi per la determinazione quantitativa degli amminoacidi in vari oggetti, si possono distinguere quattro gruppi principali: metodi di analisi cromatografici, spettrofotometrici, titrimetrici ed elettrochimici.

Metodi cromatografici

Negli ultimi decenni sono stati compiuti progressi significativi nel campo della cromatografia gas-liquido degli amminoacidi. Viene proposto un metodo che utilizza colonne microimpaccate, che consente di separare quasi completamente 17 aminoacidi biologicamente importanti in un tempo relativamente breve.

È stato sviluppato un metodo per la determinazione degli amminoacidi mediante cromatografia gas-liquido in campioni di siero, plasma, urina e liquido cerebrospinale, basato sulla preparazione di 2,3,4,5,6-pentafluorobenzoil-isobutil eteri, seguito da separazione su colonna di polidimetilsilossano nella modalità di programmazione della temperatura da 140°C a 250°C con rivelatore a ionizzazione di fiamma. Il tempo di separazione cromatografica è di 28 minuti. Come risultato della ricerca, è stato possibile separare 27 aminoacidi.

Nonostante la varietà di metodi di cromatografia liquida ad alte prestazioni nell'analisi degli amminoacidi, la versione a fase inversa con rilevamento spettrofotometrico è la più espressiva e accessibile. Per una separazione e un rilevamento di successo, gli amminoacidi vengono convertiti in derivati ​​idrofobici e che assorbono la luce, ovvero viene eseguita la derivatizzazione precolonna. Come reagenti per la derivatizzazione vengono utilizzati ortoftalaldeide, naftalene-2,3-dicarbossialdeide, 9-fluorenilmetilcloroformiato.

È stato sviluppato un metodo per la determinazione quantitativa di L-cistina, acido L-glutammico e glicina nel farmaco Eltacin, che ha attività antiossidante in combinazione con un effetto antianginoso. L'acido glutammico e la glicina sono stati determinati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa dopo derivatizzazione precolonna con reagente ortoftalaldeide/N-acetil-L-cisteina. La derivatizzazione della cisteina, secondo gli autori, è difficile a causa dell'instabilità dell'amminoacido stesso e dei derivati ​​che ne derivano. Pertanto, l'analisi della cisteina è stata effettuata con il metodo della titolazione bromatometrica. Si è riscontrato che la presenza di quantità significative di cisteina nel campione non interferisce con la determinazione dei prodotti di derivatizzazione della glicina e dell'acido glutammico con il reagente ortoftalaldeide/N-acetil-L-cisteina. Il metodo è caratterizzato da un'elevata riproducibilità e precisione di determinazione.

La possibilità di utilizzare il 4,7-fenantrolina-5,6-dione (fanchinone) come reagente fluorogenico-etichetta per la formazione in precolonna dei suoi derivati ​​per la separazione e l'analisi quantitativa di amminoacidi mediante cromatografia liquida ad alta prestazione è stata studiato. Non possedendo una propria fluorescenza, il fanchinone reagisce con gruppi amminici di aminoacidi (a 68 ° C per 160 min), formando imminochinoli, la cui fluorescenza viene misurata a una lunghezza d'onda di 460 nm. I derivati ​​isolati sono stati identificati dagli spettri Tm, IR, massa e PMR. La cromatografia liquida ad alte prestazioni è stata eseguita su un cromatografo con un rivelatore fluorescente e una colonna con eluizione a gradiente con miscele: soluzione di trietilammina - tampone fosfato (pH 3) - metanolo. La chinidina è stata utilizzata come standard interno. Questo metodo è abbastanza promettente nelle condizioni dei grandi laboratori e può essere proposto per l'analisi di amminoacidi in forme di dosaggio finite.

È stata sviluppata una tecnica per la cromatografia liquida ad alte prestazioni con un biosensore potenziometrico per la determinazione quantitativa della lisina. Il biosensore è costruito collegando una membrana contenente lisina ossidasi a un elettrodo NH4+ ionoselettivo. Gli ioni ammonio generati durante la degradazione enzimatica della lisina vengono rilevati potenziometricamente. È stato sviluppato un metodo rapido cromatodensitometrico per l'analisi del triptofano nei liquidi colturali. La cromatografia su strato sottile è stata eseguita su piastre Sorbfil. La cromatografia è stata eseguita nel sistema propanolo-2 - soluzione di idrossido di ammonio al 25% (7:3) per 25 minuti. I cromatogrammi sono stati essiccati a temperatura ambiente e mantenuti a 120°C per 15 min. Per rilevare le macchie sui cromatogrammi è stato utilizzato un reagente specifico - 4-dimetilamminobenzaldeide, selettivo all'anello indolico del triptofano, sotto forma di una soluzione di etanolo allo 0,5% con aggiunta di acido solforico concentrato al 5%. Dopo aver sviluppato i cromatogrammi per immersione in una cuvetta di teflon con una soluzione di 4-dimetilamminobenzaldeide appena preparata, sono stati mantenuti per 5-7 minuti ad una temperatura di 110°C. I punti di triptofano sono stati scansionati a una lunghezza d'onda di 625 nm utilizzando un densitometro video computerizzato. Il metodo sviluppato, nonostante l'elevata precisione di determinazione e produttività, è specifico per il triptofano.

Per l'analisi degli α-amminoacidi in fluidi biologici, farmaci e prodotti alimentari, sono ampiamente utilizzati metodi di elettroforesi capillare, basati sulla separazione dei componenti di una miscela complessa in un capillare di quarzo sotto l'azione di un campo elettrico applicato. Poiché gli amminoacidi sono di natura zwitterionica, possono essere separati utilizzando tamponi elettrolitici di pH appropriato, vengono utilizzati più comunemente tamponi di separazione neutri e basici.

Al fine di aumentare la specificità e la sensibilità del metodo di elettroforesi capillare per l'analisi dei singoli β-amminoacidi, viene utilizzata la loro derivatizzazione preliminare, seguita dalla separazione in un capillare di quarzo e dalla determinazione spettrofotometrica dei prodotti di reazione. Pertanto, come agenti derivatizzanti vengono utilizzati 9-fluorenilmetil formiato, 9-(2-carbazolo)-etil cloroformiato e colorante cianina. Le prospettive del metodo sono dovute ai suoi vantaggi quali analisi rapida, facilità di preparazione del campione, basso consumo di reagenti e facilità di strumentazione.

Questo articolo prenderà in considerazione i metodi per determinare gli amminoacidi, che vengono utilizzati non solo nell'analisi dei prodotti, ma anche nella biochimica e nell'analisi farmaceutica.

La quantità totale di amminoacidi può essere effettuata con un metodo fotometrico basato sulla determinazione dell'ammoniaca ottenuta dagli amminoacidi secondo il metodo di Kjeldahl.

Reazione con 1-naftolo. Per determinare arginina, istidina, tirosina è stata proposta una reazione con 1-naftolo. In presenza di ipoclorito di sodio (NaOCl), la soluzione diventa rossa. Una soluzione campione in etanolo al 50% contenente l'amminoacido viene raffreddata con ghiaccio e vengono aggiunti una soluzione di NaOCl al 10% e una soluzione di naftolo. Il prodotto di reazione si colora di rosso (l max = 550 nm). Il contenuto di amminoacidi è determinato dall'intensità del colore della soluzione risultante.

Reazione del biureto. Una delle reazioni più importanti utilizzate per determinare gli amminoacidi è la reazione del biureto. La reazione viene effettuata aggiungendo una soluzione acquosa diluita di sale di rame (II) ad una soluzione alcalina di biureto. In questo caso la soluzione assume un colore viola intenso per la formazione di un composto complesso.

I composti contenenti almeno 2 gruppi ammidici o un gruppo amminoidrossietilenico, nonché ammidi e immidi di amminoacidi entrano nella reazione del biureto. Proteine ​​e soluzioni concentrate di amminoacidi e ammidi danno questa reazione. Le soluzioni diluite di amminoacidi non danno una reazione del biureto e quindi la reazione può essere utilizzata per stabilire la fine dell'idrolisi proteica. La reazione viene utilizzata anche per la determinazione qualitativa e quantitativa delle proteine. I metodi utilizzati nei laboratori diagnostici clinici per la determinazione delle proteine ​​nel sangue e in altri fluidi biologici si basano sulla reazione del biureto.

reazione alla ninidrina. La seconda reazione più importante utilizzata per determinare gli amminoacidi è la reazione della ninidrina, una reazione di colore per gli a-amminoacidi, che viene effettuata riscaldando questi ultimi in una soluzione alcalina di ninidrina in eccesso.

La ninidrina effettua la decarbossilazione ossidativa degli a-amminoacidi con formazione di ammoniaca, anidride carbonica e un'aldeide contenente un atomo di carbonio in meno rispetto all'amminoacido originale. La ninidrina ridotta reagisce quindi con l'ammoniaca rilasciata e la seconda molecola di ninidrina, formando un prodotto di condensazione colorato con l'ammoniaca.

Il composto risultante (pigmento) ha un colore viola-blu (l max = 570 nm). La formazione di questo composto colorato viene utilizzata in un test quantitativo per a-amminoacidi, con il quale è possibile rilevare gli amminoacidi, anche se la loro quantità non supera 1 μg.

La prolina e l'idrossiprolina, che non hanno un gruppo a-amminico, reagiscono con la ninidrina per formare derivati ​​gialli (l max = 440 nm). La reazione non è specifica, perché un prodotto colorato con ninidrina fornisce anche ammoniaca e composti contenenti un gruppo amminico (ammine, proteine, peptidi). Tuttavia, con questi composti non viene rilasciata CO 2. Il rilascio di anidride carbonica è caratteristico solo per gli a-aminoacidi. La reazione viene utilizzata per la determinazione quantitativa colorimetrica degli a-amminoacidi, anche in analizzatori automatici di amminoacidi (misurazione del volume di CO 2).

La reazione della ninidrina viene utilizzata per determinare glicina, isoleucina, leucina; colore meno intenso è dato da serina, fenilalanina, cisteina, tirosina, triptofano, ecc.

I prodotti risultanti sono caratterizzati da un colore abbastanza intenso (e = 1,8–3,3 10 4), ma i prodotti colorati sono instabili. L'intensità del colore diminuisce rapidamente. CdCl 2 viene aggiunto per la stabilizzazione. Forma complessi stabili con i composti risultanti. Anche il cloruro di cadmio accelera la reazione.

Gli amminoacidi e alcuni altri composti contenenti un gruppo amminico si condensano in un mezzo alcalino con 1,2-naftochinone - 4-solfossilato per formare derivati ​​di colore rosso, giallo, arancione dell'1,2-naftochinone monoimmina.

La reazione viene utilizzata per determinare gli a-amminoacidi (valina, isoleucina, leucina, ecc.).

La reazione con 4-dimetilamminobenzaldeide può essere utilizzata per determinare il triptofano. Il prodotto di reazione si colora di viola e l'intensità del colore determina il contenuto di triptofano nella soluzione analizzata.

Va notato, tuttavia, che questa reazione è usata raramente nelle analisi degli alimenti.

Per la determinazione quantitativa degli amminoacidi contenenti zolfo si utilizza un metodo bromatometrico, basato sulla seguente reazione:

Una soluzione di cisteina in una soluzione di NaOH all'1% viene versata in un pallone con un tappo macinato, 0,1 N. soluzione di bromato di potassio, bromuro di potassio secco e acidificato con HCl al 10%.

BrO 3 - + 5Br - + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O

Il bromo formatosi a seguito della reazione, la cui quantità è equivalente alla quantità di bromato di potassio, reagisce con l'amminoacido. Dopo 10 minuti viene aggiunto ioduro di potassio, che reagisce con il bromo non reagito, e lo iodio rilasciato viene titolato con 0,1 N. soluzione di tiosolfato di sodio con amido come indicatore.

2I - + Br 2 → Br - + I 2

La quantità di tiosolfato utilizzata per la titolazione è equivalente alla quantità di bromo che non ha reagito con l'amminoacido. Dalla differenza tra la quantità di bromato di potassio aggiunto e tiosolfato, si trova la quantità di bromo che ha reagito con l'amminoacido, e quindi la quantità di amminoacido.

La metionina è determinata in modo simile. La metionina viene ossidata a solfone:

Questa reazione, in determinate condizioni, consente di determinare con precisione il contenuto di metionina.



Gli amminoacidi possono essere rilevati utilizzando reazioni di colore: ninidrina, xantoproteina, Fol, Milon, test del biureto, ecc. Queste reazioni non sono specifiche, perché si basano sulla rilevazione di singoli frammenti nella struttura degli amminoacidi, che possono trovarsi anche in altri composti.

Reazione alla ninidrina, una reazione cromatica utilizzata per la determinazione qualitativa e quantitativa di amminoacidi, imminoacidi e ammine. Per riscaldamento in un mezzo alcalino di ninidrina (triketoidrindenidrato, C 9 H b O 4) con sostanze aventi gruppi amminici primari (-NH 2), si forma un prodotto che ha un colore blu-violetto intenso stabile con un assorbimento massimo di circa 570 nm. Poiché l'assorbimento a questa lunghezza d'onda dipende linearmente dal numero di gruppi amminici liberi, la reazione della ninidrina è servita come base per la loro determinazione quantitativa mediante colorimetria o spettrofotometria. Questa reazione viene utilizzata anche per determinare i gruppi amminici secondari (> NH) negli imminoacidi - prolina e idrossiprolina; in questo caso si forma un prodotto giallo brillante. Sensibilità - fino allo 0,01%. La moderna analisi automatica degli amminoacidi viene eseguita combinando la separazione per scambio ionico degli amminoacidi e la loro determinazione quantitativa utilizzando la reazione della ninidrina. Quando si separano miscele di amminoacidi mediante cromatografia su carta, ciascun amminoacido può essere determinato in una quantità di almeno 2-5 µg.

La quantità di amminoacidi può essere giudicata dall'intensità del colore.

Questa reazione è positiva non solo con gli amminoacidi liberi, ma anche con peptidi, proteine, ecc.

reazione xantoproteica permette di rilevare aminoacidi aromatici (fenilalanina, tirosina, istidina, triptofano), in base alla reazione di sostituzione elettrofila nel nucleo aromatico (nitrazione).

Sotto l'azione dell'acido nitrico concentrato, ad esempio sulla tirosina, si forma un prodotto giallo.

La reazione di Fohl. Questa è una reazione alla cisteina e alla cistina. Durante l'idrolisi alcalina, lo "zolfo debolmente legato" in cisteina e cistina si stacca piuttosto facilmente, determinando la formazione di acido solfidrico, che, reagendo con gli alcali, dà solfuri di sodio o potassio. Quando si aggiunge acetato di piombo (II), si forma un precipitato grigio-nero di solfuro di piombo (II).

Descrizione dell'esperienza. Versare 1 ml di soluzione di cistina in una provetta, aggiungere 0,5 ml di soluzione di idrossido di sodio al 20%. La miscela viene riscaldata fino a ebollizione, quindi vengono aggiunti 0,5 ml di soluzione di acetato di piombo (II). Si osserva un precipitato grigio-nero di solfuro di piombo (II):

reazione di Zimmermann. Questa è una reazione all'amminoacido glicina.

Descrizione dell'esperienza. A 2 ml di una soluzione allo 0,1% di glicina, regolata aggiungendo una soluzione al 10% di alcali a pH = 8, versare 0,5 ml di una soluzione acquosa di dialdeide o-ftalica. La miscela di reazione inizia a diventare lentamente verde brillante. Dopo alcuni minuti appare un precipitato verde.

risposta al triptofano. Il triptofano, reagendo in ambiente acido con le aldeidi, forma prodotti di condensazione colorati. Ad esempio, con l'acido gliossilico (che è un'impurità per l'acido acetico concentrato), la reazione procede secondo l'equazione:

La reazione del triptofano con la formaldeide procede secondo uno schema simile.

La reazione di Sakaguchi. Questa reazione all'amminoacido arginina si basa sull'interazione dell'arginina con l'α-naftolo in presenza di un agente ossidante. Il suo meccanismo non è stato ancora del tutto chiarito. Apparentemente, la reazione viene eseguita secondo la seguente equazione:

Poiché i derivati ​​delle chinoneimmine (in questo caso il naftochinone), in cui l'idrogeno del gruppo imminico –NH– è sostituito da un radicale alchilico o arilico, sono sempre colorati in toni giallo-rosso, allora, a quanto pare, il colore rosso-arancio della soluzione durante la reazione di Sakaguchi è dovuto alla comparsa appunto del derivato della naftochinoneimina. Non è però esclusa la possibilità della formazione di un composto ancora più complesso a causa dell'ulteriore ossidazione dei restanti gruppi NH del residuo di arginina e dell'anello benzenico dell'α-naftolo:

Descrizione dell'esperienza. Versare 2 ml di una soluzione allo 0,01% di arginina in una provetta, quindi aggiungere 2 ml di una soluzione al 10% di idrossido di sodio e alcune gocce di una soluzione alcolica allo 0,2% di α-naftolo. Il contenuto della provetta viene miscelato bene, si aggiungono 0,5 ml di soluzione di ipobromite e si mescola nuovamente. Si aggiunge immediatamente 1 ml di una soluzione di urea al 40% per stabilizzare il colore rosso-arancio a rapido sviluppo.

Reazione del biureto- usato come reazione cromatica per le proteine. In ambiente alcalino in presenza di sali di rame(II) danno un colore violaceo. Il colore è dovuto alla formazione di un composto complesso rame(II), dovuto al gruppo peptidico -CO-NH- che è caratteristico delle proteine. Questa reazione ha preso il nome dal derivato dell'urea - biureto, che si forma riscaldando l'urea con l'eliminazione dell'ammoniaca:

Oltre alle proteine ​​​​e al biureto, anche altri composti contenenti questo gruppo danno la stessa colorazione: ammidi, immidi di acidi carbossilici, nonché composti contenenti gruppi -CS-NH- o \u003d CH-NH- nella molecola. Anche le proteine, alcuni amminoacidi, peptidi, biureto e peptoni medi danno la reazione.

Il colore del complesso ottenuto dalla reazione del biureto con diversi peptidi è alquanto diverso e dipende dalla lunghezza della catena peptidica. Peptidi con una lunghezza della catena di quattro residui di amminoacidi e superiore formano un complesso rosso, tripeptidi - viola e dipeptidi - blu.

forma chetonica di un polipeptide

forma enolica di un polipeptide

Quando il polipeptide interagisce con Cu (OH) 2, si forma un complesso la cui struttura può essere mostrata come segue.

Attrezzatura e reagente: carta cromatografica; camera cromatografica; colorimetro fotoelettrico; forbici; lastre di vetro (3x32 cm) - 3 pz.; supporto per cromatogrammi; armadio di essiccazione; micropipette; provette con tappi rettificati; buretta 25 ml; miscela standard di amminoacidi; miscela di prova di amminoacidi; butanolo, acido acetico, acqua nel rapporto 15:3:7; Soluzione all'1% di ninidrina in acetone al 95%; alcool etilico (75%), saturo di solfato di rame.

Completamento dell'opera

Prendi un foglio di carta cromatografica di 18x28 cm e traccia una linea orizzontale con una matita semplice a una distanza di 3 cm dal suo bordo corto. Quindi viene suddiviso in segmenti disuguali secondo lo schema allegato e i limiti di applicazione della norma e delle miscele di prova sono contrassegnati da frecce e le iscrizioni corrispondenti sono realizzate con una semplice matita.

La carta viene fissata sopra la superficie del tavolo e sulla linea di partenza, delimitata dalle frecce, la miscela standard viene prima applicata con una micropipetta speciale in una linea sottile fino a quando l'intera soluzione dalla micropipetta non viene trasferita alla linea di partenza (la micropipetta viene riempita 2-3 cm). La massa della soluzione applicata viene misurata pesando la pipetta riempita con la miscela standard (prima di applicare la soluzione) e vuota (dopo aver applicato la soluzione). Sulla carta vengono solitamente applicati 0,02-0,03 g della soluzione standard. Quindi riempire una pipetta pulita con la miscela di aminoacidi da testare (fornita dal docente per lo studio), pesarla e applicare la miscela sulla linea di partenza con il segno appropriato.

Il cromatogramma preparato viene posto in una camera cromatografica in cui è stato precedentemente versato un sistema di solventi per separare una miscela di amminoacidi, ad esempio una miscela di butanolo, acido acetico e acqua in un rapporto di 15:3:7. La separazione viene effettuata mediante cromatografia ascendente fino a quando la linea frontale non raggiunge 2-3 cm dal bordo superiore della carta cromatografica (linea del traguardo). Successivamente, il cromatogramma viene rimosso dalla camera e l'estremità superiore della carta viene immediatamente inserita in un supporto costituito da tre bacchette di vetro fissate con un anello di gomma e posta in una cappa per 20 minuti per rimuovere i solventi dalla carta.

Riso. 8. Schema della disposizione degli amminoacidi sul cromatogramma:

A - punto di applicazione di una miscela di aminoacidi; I - cistina e cisteina;

2 - lisina; 3 - istidina; 4 - arginina; 5 - acido aspartico,

serie e glicina; 6 - acido glutammico e treonina; 7 - alanina;

8 - prolina; 9 - tirosina; 10 - valina e metionina; II - triptofano;

12 - fenilalanina; 13 - leucina e isoleucina

Il cromatogramma essiccato viene immerso in una soluzione all'1% di ninidrina in acetone per rilevare le posizioni delle macchie di amminoacidi su di esso. Quindi il cromatogramma viene posto per 10 minuti in una cappa aspirante per rimuovere l'acetone e trasferito in un forno, dove viene lasciato per 15 minuti a 70°C. Gli amminoacidi della miscela standard e di prova vengono rilevati come macchie blu-viola disposte in una catena nella direzione del sistema solvente dalla linea di partenza al bordo superiore del cromatogramma.

L'identificazione degli amminoacidi contenuti nella miscela di prova viene effettuata casualmente sul cromatogramma delle posizioni occupate dagli amminoacidi della miscela standard e di prova (Fig. 8).

Per determinare il contenuto quantitativo di amminoacidi nelle miscele in esame, il cromatogramma viene disegnato con una matita semplice in modo che le zone colorate giacenti sullo stesso livello, corrispondenti allo stesso amminoacido, siano racchiuse all'interno di rettangoli approssimativamente identici (Fig. 9). .

I II III IV

Riso. 9. Schema della disposizione degli amminoacidi sul cromatogramma:

I - miscela n. I; II - miscela n. 2; 1U - miscela n. 3; Ø - standard

miscela di aminoacidi

Le sezioni di carta delineate vengono ritagliate e poste in provette, il cui numero dovrebbe corrispondere al numero di macchie sui cromatogrammi. 10 ml di una soluzione al 75% di alcol etilico satura di solfato di miele vengono versati in ciascuna provetta da una buretta (a 500 ml di alcol etilico vengono aggiunti 0,2 ml di una soluzione satura di solfato di rame). La provetta viene chiusa con un tappo di sughero e, agitando periodicamente, si ottiene un completo passaggio del colore rosso mattone (sale di rame del blu-viola di Rueman) dalla carta alla soluzione. Questo richiede 15-20 minuti. L'assorbanza (densità ottica) delle soluzioni standard e test viene misurata su un fotoelettrocalorimetro con filtro a luce verde (540 nm). Nel flusso di riferimento è installata una cuvetta con una soluzione al 75% di alcol etilico con solfato di rame.

Il contenuto quantitativo di amminoacidi nella soluzione in esame è calcolato dal rapporto tra le estinzioni del test e dei campioni standard.

Esempio di calcolo. Si supponga che la miscela standard contenga 1,8 mg di glicina in 1 ml, si applicano 0,02 g di questa soluzione standard sulla striscia di partenza. Pertanto, il cromatogramma ha ricevuto (1,8 × 0,02) = 0,036 mg di glicina. Conveniamo inoltre che l'assorbanza delle soluzioni colorate era 0,288 per lo standard e 0,336 per la miscela sconosciuta. Quindi il contenuto di glicina nella miscela di prova applicata al cromatogramma sarà (36´0,336): 0,288=42 µg. Se assumiamo inoltre che la miscela di prova venga applicata al cromatogramma in una quantità, ad esempio, di 0,0250 g, il contenuto di glicina in 1 ml della soluzione di prova sarà (42: 0,0250) = 1680 μg, o 1,68 mg / ml.

Elabora i risultati del tuo esperimento, trai conclusioni da essi.

Laboratorio n. 15

Separazione ionicaFe 3+ , co 2+ , Ni 2+

E proteine

È noto che tutte le 20 varietà di α-amminoacidi canonici hanno la stessa struttura, con tre varianti di gruppi funzionali (Fig. 3.3). Sfortunatamente, le reazioni ai gruppi amminici e carbossilici non sono molto specifiche, perché rispettivamente, caratteristico di tutte le ammine, un certo numero di ammidi e acidi carbossilici. Lo stesso vale per la maggior parte dei loro radicali = R, di cui 10 non polari, cioè rappresentati da gruppi alifatici = idrocarburici, la maggior parte dei quali chimicamente inerti. Anche la specificità della maggior parte degli amminoacidi polari R è relativamente bassa, in cui sono presenti gruppi alcolici (Ser, Tre, Tyr) ammidici (Acn, Gln) e carbossilici (Asp, Glu). Il gruppo amminico (Liz), l'imidazolo His e il gruppo guanidino Arg sono più attivi, mentre l'attività del gruppo tio Cys è la più alta. Pertanto, la reazione universale della ninidrina, specifica per la presenza simultanea di gruppi amminici e carbossilici nell'atomo α-C, ha ricevuto il massimo significato pratico nell'analisi qualitativa e quantitativa degli α-amminoacidi, anche negli analizzatori di amminoacidi.

Riso. 3.3. Formule generali per la struttura degli α-amminoacidi e il loro prodotto di polimerizzazione. Spiegazioni nel testo.

La polimerizzazione degli α-amminoacidi nella struttura dei peptidi e delle proteine ​​(Fig. 3.3) conserva tutti i tipi della loro R, ma:

1. La reazione della ninidrina diventa negativa, perché con l'eccezione dei gruppi N- e C-terminale, i gruppi α-amminici e α-carbossilici vengono spesi per la formazione di legami peptidici. Una reazione positiva della ninidrina con le proteine ​​indica piuttosto la presenza di impurità aminoacidiche nella preparazione o nei piatti.

2. Per tutti i peptidi e le proteine, la reazione del biureto al gruppo peptidico, che è assente negli amminoacidi monomerici, è specifica.

3. Tra le reazioni più specifiche agli amminoacidi R, sono utili: reazione xantoproteica con acido nitrico concentrato, agli aromatici R Phe, Tyr, Tri; la reazione con l'isatin per l'anello a cinque membri Pro, così come le reazioni per l'imidazolo R His, il gruppo tio Cys e il gruppo guanidino Arg. È importante tenere conto del fatto che alcune di queste R sono nascoste all'interno dei globuli proteici e quindi le reazioni qualitative ad esse sono indebolite. Pertanto, prima di essere eseguite, le proteine ​​vengono solitamente denaturate in un modo o nell'altro.

4. A differenza delle vere soluzioni di amminoacidi, le soluzioni colloidali di proteine ​​sono caratterizzate da reazioni sedimentarie associati alla distruzione dei loro gusci di idratazione e, di conseguenza, a una diminuzione della loro solubilità sotto l'azione di agenti di rimozione dell'acqua: sali neutri = salatura, metanolo = MeOH, etanolo = EtOH, acetone, urea e altri agenti.

Eseguendo reazioni qualitative, dovresti:

1. Seguire attentamente le regole di sicurezza antincendio e lavorare con acidi e alcali concentrati = EJ.

2. Segnare 2 file di provette con un vetrografo o un pennarello e inserire in una di esse non più di 0,5 ml (2-5 gocce) di soluzione di amminoacidi all'1% e nell'altra - approssimativamente lo stesso volume di Soluzione proteica all'1%.

3. In una coppia di provette con soluzioni di amminoacidi e proteine, aggiungere in parallelo 3-5 gocce dei corrispondenti reagenti ed eseguire le restanti procedure indicate per la reazione corrispondente.

4. Se è necessario riscaldare le provette, rimuovere il coperchio del crogiolo e dare fuoco al combustibile secco con un fiammifero. Quindi, fissa la provetta nel supporto, il cui design primitivo è molto inaffidabile. Pertanto, è meglio avvolgere un paio di provette con un pezzo di carta piegato in una striscia e, tenendole con il pollice, passare uniformemente le metà inferiori delle provette attraverso la fiamma, evitando la direzione dei colli sui vicini e la rapida ebollizione della soluzione. Dopo aver completato l'operazione, spegnere tempestivamente la fiamma con il coperchio del crogiolo.

5. I risultati degli esperimenti, secondo il modello, redigono sulla diffusione di un quaderno di laboratorio sotto forma di tabella:

6. Dopo aver considerato i risultati e, dopo aver completato il protocollo, insieme a un rack di provette, presentarli al docente per la protezione.

1. Reazione alla ninidrina. Basato sulla deaminazione e decarbossilazione di α-amminoacidi con una soluzione alcolica di ninidrina:

L'ammoniaca risultante, reagendo con due molecole di ninidrina, forma un derivato colorato con un assorbimento massimo a 540 nm (per Pro - 440 nm).

Progresso: Aggiungere 3-5 gocce di soluzione alcolica allo 0,5% di ninidrina ai campioni in studio. Riscaldare delicatamente le provette con le miscele su una fiamma e dopo 2-3 minuti registrare l'aspetto del colore.

2. Reazione xantoproteina. Come accennato in precedenza, si basa sulla formazione di nitroderivati ​​di amminoacidi con R aromatico: Phen, Tyr, Tri.

Progresso: Accendendo il tiraggio della cappa, aggiungere con cautela alcune gocce di acido nitrico concentrato (HNO 3) a un paio di provette con soluzioni di prova. Scaldare delicatamente le provette su una fiamma, evitando la direzione dei colli verso le vicine, e registrare lo sviluppo del colore.

3. Reazione al nitroprussiato. Si basa sull'idrolisi alcalina dell'amminoacido cisteina contenente zolfo, con rilascio di solfuro di sodio (Na 2 S), che dà un complesso rosso con una soluzione di nitroprussiato di sodio appena preparata.

Progresso: Aggiungere un volume uguale di idrossido di sodio al 20% in entrambe le provette con 5-10 gocce di soluzioni di prova e far bollire per almeno 3-5 minuti. Aggiungere 3-5 gocce di soluzione di nitroprussiato di sodio alle provette e registrare lo sviluppo del colore.

4. Reazione del biureto. Si basa sulla formazione in un mezzo alcalino di un complesso colorato di un legame peptidico con uno ione Cu 2+. Serve come test universale per il rilevamento di peptidi e proteine ​​nelle soluzioni. Poiché con un aumento del numero di legami peptidici, l'intensità del colore della soluzione aumenta linearmente, è ampiamente utilizzata per la determinazione fotometrica delle concentrazioni proteiche.

Progresso. Aggiungere la stessa quantità di soluzione di idrossido di sodio al 10% alle provette con 5-10 gocce di soluzioni di prova. Mescolare bene e aggiungere 2 gocce di soluzione di solfato di rame all'1% (CuSO 4). Mescolare i campioni e dopo qualche minuto registrare lo sviluppo del colore.

5. Provare con l'ebollizione. Basato sulla denaturazione termica delle proteine.

Progresso. Acidificare entrambe le provette con soluzioni di prova con non più di una goccia di soluzione di acido acetico all'1% (AcOH) e portare a ebollizione. Dopo aver fatto bollire le soluzioni per 2-3 minuti, registrare i risultati e spiegare il meccanismo del fenomeno.

6. Precipitazione con sali di metalli pesanti(Me) . Le loro proprietà denaturanti si basano sulla capacità dei cationi Me pesanti di reagire con i gruppi funzionali R della molecola proteica: tio-, amino-, carbossi-, aromatica. Inoltre, i loro forti anioni causano la ricarica dei gruppi ionogenici nelle molecole proteiche, distruggendo così i legami ionici in esse contenuti.

Progresso. Aggiungere alcune gocce di una soluzione al 5% di solfato di rame (CuSO 4) in entrambe le provette con le soluzioni di prova. Registra e spiega i risultati.

7. Precipitazione con acidi organici. Si basa sulla denaturazione acida delle proteine ​​e sulla formazione di derivati ​​covalenti di gruppi tio, amino e aromatici di amminoacidi R con organoclorurati.

Progresso. Aggiungere alcune gocce di una soluzione al 10% di acido tricloroacetico (TCA) alle provette con le soluzioni di prova e registrare i risultati in pochi minuti